云南某地區少數民族農戶自制酥油中常見致病菌的檢測

陳兆芳，曹曉蘭，余文靜，杜 涓，武有聰*

（1.大理大學基礎醫學院，云南大理 671000；2.大理護理職業學院基礎醫學部，云南大理 671000）

我國飼養乳畜、制作食用乳和乳制品的歷史非常悠久。酥油作為中國藏區傳統乳制品之一，頗受游牧民族的青睞〔1〕。酥油是從牛奶、羊奶中提煉出來類似黃油的以脂肪為主要成分的乳制品，維生素和微量元素含量高，常用于營養補充、皮膚護理、腸胃調理等〔2-3〕。酥油制作方法簡單，但制作程序多，制作過程中易被微生物污染。提取的酥油平均含水量約為10%，高水分與高不飽和脂肪酸使酥油在儲存和運輸過程中易腐敗變質，保存期不宜超過半年〔4-5〕。酥油豐富的營養物質和較高的水分含量為微生物的滋生與繁殖創造了非常適宜的環境條件。有研究〔6-7〕表明酥油中含62種細菌和18種真菌，常見的病原菌有金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門菌和志賀菌等。酥油中微生物的種類和數量直接影響酥油的品質和食用安全〔8〕。目前有關云南少數民族地區酥油中微生物種類及常見病原菌的研究較少。云南西北部少數民族主要以藏族、納西族、白族和彝族為主，各少數民族為適應滇西北高海拔的自然環境，創造了各具特色的生產、生活方式和風俗習慣。酥油作為云南高海拔地區少數民族的特有食品，在高寒山區少數民族生活中尤為重要。本項目基于酥油易污染變質，難于長期保存的實際情況，從菌落計數和分離培養兩方面探索云南少數民族農戶自制酥油中的細菌總數和常見病原菌種類，為少數民族地區酥油的安全食用提供參考。

1 材料與方法

1.1 培養基的制備 平板計數瓊脂培養基（PCA）23.5g，加去離子水1 000 mL，121℃滅菌20 min，分裝于無菌平皿（20 mL/皿），冷卻備用。孟加拉紅瓊脂36.6 g，加熱溶解于1 000 mL去離子水中，121℃滅菌20 min，分裝備用。沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）：稱取蛋白胨10.0 g，瓊脂粉20.0 g，葡萄糖40.0g，加去離子水定容至1 000 mL，115℃滅菌20 min，置于60℃水浴箱恒溫，加抗生素（青霉素100 μg/mL，氯霉素10 μg/mL）后混勻，分裝備用。結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）41.5 g，加熱溶解于1 000 mL蒸餾水中，煮沸后置于45℃水浴箱備用（用時配制）。Baird-Parker瓊脂50.1 g，溶解于1 000 mL去離子水，121℃滅菌20 min，分裝備用。麥康凱培養基50.0 g，加熱溶解于1 000 mL去離子水中，121℃滅菌20 min，分裝備用。上述培養基均購自北京路橋技術有限公司。

1.2 酥油樣品采集 于2017年10—12月先后2次采集云南省麗江市某鄉高海拔地區農戶傳統手工自制酥油樣品35份。固體食品樣品采用“三層五點”的采樣原則〔9〕，用無菌刀具在每份酥油樣品的5個部位取樣。樣品放入無菌袋中置于冰盒保存，及時送檢。

1.3 菌落總數測定 稱取樣品（25 g/份）放入無菌均質袋中，加入225 mL 0.9%氯化鈉水溶液（1∶10），37℃振蕩溶解，制成酥油原液，經10倍系列稀釋（1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000）后取1 mL樣品涂布于PCA，每個濃度梯度涂布3個平皿，37℃培養24 h計數。28℃培養5 d，用孟加拉紅瓊脂平板對霉菌/酵母菌總數計數。菌落總數30~300 CFU為有效范圍。

1.4 霉菌/酵母菌鑒定 酥油原液采用分區劃線法接種于含抗生素的SDA，28℃培養3~5 d觀察結果。通過菌落特征及形態染色鑒定。肉眼見絲狀型菌落，鏡下有菌絲者鑒定為霉菌；呈酵母型或類酵母型菌落，僅有孢子相者鑒定為酵母菌。

1.5 常見致病菌的分離鑒定 酥油原液接種于VRBA平板鑒定大腸埃希菌〔10〕，接種于Baird-Parker平板鑒定金黃色葡萄球菌〔11〕，接種于麥康凱培養基鑒定腸道致病菌。樣品接種后37℃培養24 h觀察結果，疑似致病菌結合菌落形態、染色特性、生化反應及血清學試驗綜合鑒定。

1.6 統計分析 實驗數據采用GraPhpad Prism 8.0統計分析，酥油中的菌落總數以（±s）表示，并取自然對數值進行分析。

2 結果

2.1 菌落總數檢測結果35份酥油樣品涂布于PCA，檢出細菌的樣品數35份，檢出率100.0%；酥油樣品中細菌菌落總數的lgCFU為（4.08~5.31）/g，細菌lgCFU平均值為（4.97±4.81）/g，酥油樣品細菌菌落總數超標（CFU>3×104/g）26份，超標率74.3%。35份酥油樣品涂布于孟加拉紅平板進行CFU計數，檢出霉菌/酵母菌31份，檢出率88.6%；霉菌/酵母菌菌落總數lgCFU為（2.00~4.98）/g，lgCFU均值為（4.31±4.42）/g，檢出真菌的31份標本霉菌/酵母菌總數均超過標準。見表1。

表1 云南某地區農戶自制酥油樣品微生物檢測結果（x±s）

2.2真菌檢測結果35份酥油樣品采用分區劃線法接種于含抗生素的SDA，檢出真菌陽性標本28份，檢出率80.0%，其中，同時含有霉菌及酵母菌的樣本9份，僅含酵母菌的樣本19份。

2.3 食源性致病菌的檢測與鑒定結果35份酥油樣品接種于麥康凱培養基中，檢出陽性樣品（乳糖不發酵無色菌落，G-菌）4份，疑似腸道致病菌檢出率為11.4%（4/35）。4株疑似腸道致病菌通過生化反應進一步鑒定，3株菌（SY-5、SY-8和SY-9）在KIA培養基上的結果為：乳糖（-）、葡萄糖（+）、氣體（-）、H2S（-），在MIU培養基上的結果為：動力（-）、吲哚（-）、尿素（-），鑒定為志賀菌（Shigella）；1株菌（SY-7）在上述2種培養基上的結果分別為：乳糖（-）、葡萄糖（+）、氣體（+）、H2S（-），動力（+）、吲哚（-）、尿素（+），鑒定為普通變形桿菌（Proteus vulgaris）。35份酥油樣品中均未檢出大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌。見表1。

3 討論

酥油是從牛奶、羊奶中提煉出的脂肪，富含多種維生素，滋潤胃腸，和脾溫中，常用做酥油茶、酥油糌粑、糕點配料等，具有較高的營養價值〔12〕。此外，酥油還具有食療及保健功效，常用于游牧民族兒童潤膚、皮膚外傷、便秘、新生兒硬腫癥、壓瘡等護理治理，素有“奶中黃金”之稱，尤其以牦牛乳加工的藏式酥油最受歡迎〔13-16〕。酥油與高海拔地區少數民族的生活息息相關，其制作方法簡單，多以家庭式及小作坊式制作為主，標準化生產的酥油只占市場份額的30%左右，這種生產方式決定了其在制作過程中極易被病原微生物污染〔17-18〕。

目前，我國尚無針對酥油的食品微生物學檢測方法及各項微生物指標的相關規定。本實驗采用國家標準GB 4789.15—2016進行霉菌/酵母菌計數〔19〕，并參照王秋玲〔20〕報道的西藏地方衛生微生物標準要求，酥油中細菌總數應不高于3.0×104CFU/g（lgCFU≤4.48/g），霉菌/酵母菌總數不高于50 CFU/g（lgCFU≤1.70/g），致病菌如金黃色葡萄球菌、志賀菌、沙門菌等不得檢出。本實驗采集的云南某地區少數民族家庭自制酥油35份，細菌和霉菌/酵母菌檢出率分別為100.0%和88.6%，35份酥油樣品中細菌菌落總數lgCFU均值為（4.97±4.81）/g，細菌菌落總數超標率為74.3%，霉菌/酵母菌菌落總數lgCFU均值為（4.31±4.42）/g，霉菌/酵母菌菌落總數超標率為88.6%。此外，分離培養初步鑒定出3株志賀菌和1株普通變形桿菌。采用本實驗室保存的2種痢疾志賀菌診斷血清（血清型別不詳）進行玻片凝集反應，進一步確定分離病原菌的血清型，結果未見明顯凝集，提示這3株志賀菌并非這2種血清型。35份酥油樣品中未分離到金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌。上述結果提示，本地區家庭自制酥油的衛生微生物安全令人擔憂，回顧采樣地點推測，可能與農戶家庭條件差，環境潮濕，無冰箱儲存酥油，個人衛生習慣差等因素有關。達娃卓瑪〔21〕對西藏各地220份酥油進行微生物檢測，發現酥油樣品中細菌菌落總數lgCFU均值為（3.71±1.13）/g，霉菌/酵母菌菌落總數lgCFU均值為（3.97±1.33）/g，220份樣品中均分離到金黃色葡萄球菌（檢出率100.0%），本實驗中酥油的細菌菌落總數及霉菌/酵母菌菌落總數比達娃卓瑪的結果偏高，但未檢出金黃色葡萄球菌，檢出3株志賀菌，并且酥油樣品菌落計數的標準差較大，這可能與酥油的自動化、標準化制作比例低有關，小作坊、一家一戶式的制作方式和習慣，制作環境和個人因素對酥油產品質量的影響較大。

有研究〔22〕表明，微生物的種類和數量直接影響酥油產品的風味、品質和安全性。酥油樣品中優勢細菌種群主要為乳球菌、假單胞菌、鏈球菌和乳桿菌，優勢真菌主要為酵母菌（約50%為假絲酵母），霉菌易引起酸敗及產生毒素，影響酥油的食品安全。本實驗通過孟加拉紅平板CFU計數檢出真菌陽性酥油樣品31份（檢出率88.6%）；通過分區劃線接種于SDA檢出真菌陽性樣品28份（檢出率80.0%），檢出結果的差別可能是由于CFU計數和分區劃線2種檢測方法的樣本接種量不同引起。SDA檢出的28份樣品中有9份被霉菌污染，應警惕食用酥油引起的真菌感染或中毒。本實驗未對酥油中酵母菌的種類及數量進行鑒定，采集的樣品數量亦有限，尚不能準確反映該地區酥油中益生菌的衛生指標。

綜上所述，該地區酥油食品存在安全隱患，相關衛生部門應加強牦牛及其乳制品的衛生監管，制定酥油的食品衛生微生物學國家標準，提倡擠奶前清潔牦牛乳房，牛奶進行巴氏消毒，注意個人衛生，保持環境清潔，消毒器皿，低溫或冷凍儲存，取締衛生不達標的小作坊，加快推進酥油制作的程序化、標準化、機械化，以促進少數民族地區乳制品的健康發展。