中藥益精方對精索靜脈曲張大鼠精子質量的影響

李維仁 褚云香 賈金銘

1.北京航天總醫院泌尿外科（北京 100076）；2.應急總醫院消化內科（北京 100028）；3.中國中醫科學院廣安門醫院男科（北京 100053）

精索靜脈曲張(varicocele,VC)是引起男性不育的常見原因，成年男性發病率為10%～25%，精液常規異常的病人中，VC 患病率為25%～40%[1-2]。VC 導致不育癥的病理機制雖然也有大量的研究，如睪丸溫度增高、毒素返流、自由基損害等學說，但迄今為止，仍未能清楚解釋VC 降低生育力的確切機制[3]。西醫臨床中，VC 的治療以手術為主，但是對有些患者的精液質量改善也不是很理想。而中醫臨床中發現，中藥益精方對不育患者有較好的療效[4-6]。為彌補西醫治療方案的不足，我們有必要探索一條新的中西醫結合的治療道路，以便更好的服務于廣大的VC不育患者。

材料與方法

一、實驗動物及分組

動物及分組：SPF 級SD 雄性大鼠30 只(北京大學第一醫院動物實驗中心提供)，體重(180±20)g。常規飼養，整個實驗過程中動物自由攝食飲水，室溫控制在20-25℃，相對濕度為40%-60%。適應一周后開始實驗。將雄性SD 大鼠隨機分為3 組，每組10 只，即對照組(假手術組)、VC模型組和治療組。

二、藥物及試劑

益精方是由當歸、紅花、菟絲子、五味子、仙靈脾等12 味中草藥組成，并由中國中醫科學院廣安門醫院藥劑科按含生藥量2.6g/mL 的標準煎制成標準濃度的益精方水煎劑。精液分析儀（北京偉力）、TUNEL染色試劑盒（Roche 公司）、MDA試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司)、精子核DNA完整性檢測試劑盒(精子染色質擴散法)（深圳華康生物醫學工程有限公司）。

三、造模及給藥方法

精索靜脈曲張大鼠動物模型的制備[6]：SD 大鼠適應環境1 周后，隨機分組，進行手術。10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開腹分離，并于左腎靜脈與下腔靜脈之間用4-0 絲線將直徑約為0.8mm 的金屬桿與左腎靜脈一起結扎。抽出金屬桿，使左腎靜脈復通，造成左腎靜脈的部分狹窄。對照組取假手術組大鼠，即顯露左腎靜脈過程相同，但不結扎。

造模成功后，益精方治療組給予益精方中藥水煎劑按生藥1mL/(100 g體重·d)灌胃，給予每天1次，連續8 周，對照組及模型組給予對等量的水灌胃，8 周后取材，進行后續實驗研究。

四、標本采集

造模8 周后取材，先稱重動物，用頸脫臼法處死大鼠，剪開腹腔，暴露左側精索靜脈，再次用千分尺在髂腰靜脈水平測量左側精索靜脈的外徑，以直徑增加2倍或更多為精索靜脈曲張模型造模成功，測量后切取睪丸、附睪。附睪取精液進行精子活力、脂質氧化水平、精子DNA碎片率等相關檢測。睪丸組織用Bouin液固定。常規石蠟包埋，切片厚度5μm，進行HE染色。

五、檢測項目及方法

通過精液分析及約翰遜評分（Johnson score）評估大鼠睪丸的生精功能。通過睪丸TUNEL染色觀察生精細胞凋亡情況。通過ELLISA檢測大鼠附睪組織MDA的水平，評估脂質氧化的水平。精子DNA 完整性檢測用染色質擴散法（sperm chromatin dispersion，SCD），計算精子DNA 碎片率（DNA fragmentation index，DFI）。

六、統計學方法

采用SPSS22.0統計學軟件處理。計量資料以均數±標準差（）表示，計量資料組間比較采用方差分析，計數資料采用卡方檢驗。P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

益精方治療組與較模型組比較，精索靜脈曲張大鼠睪丸約翰遜評分（Johnson score）(9.2±0.51 vs 8.1±0.42 P ＜0.05)、精子活率(59.81±5.27 vs 53.32±4.95 P ＜0.05)、附睪MDA 含量(7.53±1.86 vs 10.40±2.58 mmol/g P ＜0.05)、精子 DNA 碎 片 率 (13.30±2.39 vs 18.36±3.29 % P ＜0.01）、睪丸生精細胞凋亡率(2.87±1.21 vs 5.2±1.74%P ＜ 0.05)差異顯著。

表1 益精方治療組對約翰遜評分、精子活率、MDA水平、DFI水平、生精細胞凋亡的影響

圖1 大鼠睪丸HE染色

圖2 大鼠睪丸TUNEL染色

討 論

VC 是男性不育癥的常見病因之一。目前西醫治療多采用精索靜脈高位結扎術，手術只能解決精索靜脈血液返流的問題，而對部分患者不能從根本上改善睪丸生精功能的問題。目前西醫方法尚無特效藥物，但是中醫藥在此方面獨具優勢。

祖國傳統醫學中，VC不育屬筋瘤、筋疝、無子等范疇，其病因病機復雜，概括起來不外虛實二端，以腎虛為本，血瘀為標，腎虛導致血瘀，血瘀加重腎虛，互為因果，相互影響，造成生殖之精化生障礙，從而導致不育。益精方由當歸、紅花、丹參、仙靈脾、菟絲子等組成。仙靈脾、菟絲子補腎以生精，當歸、紅花、丹參等活血化瘀，標本兼顧，使腎氣得以充，瘀血得以去，生精功能得以恢復，達到治療不育的目的[4-6,8-9]。

研究表明，活性氧(ROS) 增多及抗氧化能力的下降導致氧化應激損傷精子DNA[10]。其機制可能與疾病、環境和生活方式等因素所導致的生精細胞的凋亡、過多氧自由基的產生及染色質包裝過程異常有關[11-13]。DNA 受損的精子即使有能力受精，后期胚胎發育也有可能出現異常。不育和后代基因異常也和父系精子DNA損傷有關[14-15]。我們課題組前期的研究發現，益精方可以減少氧化應激損傷，抵抗氧化應激，可介導PI3K/Akt/mTOR信號通路調控自噬抑制Leydig 細胞凋亡，從而改善少弱精子癥的精子質量[6,16]。另有研究發現，精索靜脈曲張伴精子DFI 升高的患者術后聯合維生素E或輔酶Q10 等抗氧化治療可以進一步降低精子DFI，提升精子質量[17]。我們也發現，與模型組比較，治療組大鼠睪丸MDA含量顯著降低，這也證實了益精方可以減少睪丸的氧化損傷。進而發現益精方治療組大鼠睪丸的生精細胞凋亡減少，DNA碎片率減少。因此，我們推測，益精方的抗氧化、抗凋亡效應可能起到保護VC 大鼠的睪丸的作用。

綜上，中藥益精方能提高精索靜脈曲張大鼠的精子質量，其抗氧化效應可能在精索靜脈曲張大鼠的睪丸保護中扮演重要的角色。