microRNA與雄性生育功能關系的研究進展

田 輝 趙曉曦

內蒙古醫科大學第一臨床醫學院內蒙古醫科大學附屬醫院（內蒙古 呼和浩特 010000）

microRNA（miRNA）是一類長度大約18-24個核苷酸的非編碼RNA。miRNA 的產生是在細胞核中的RNA 聚合酶II（RNA polymerase II）的作用下，生成長度可達1000 個核苷酸并帶有發夾結構的pri-miRNA，pri-miRNA 經過一種被稱為“Drosha”的核糖核酸酶III(RNase III) 進一步加工，產生 miRNA 的前體(pre-RNA)，之后被exportin-5 轉運到細胞質中，再由另一種核糖核酸酶III“Dicer”對pre-RNA 進行處理，產生一條雙鏈miRNA，又經AGO2蛋白做最后處理，從而產生一條成熟的miRNA[1]。miRNA的主要調節方式是通過其5′端的2-8個核苷酸序列，與靶mRNA的3′-非編碼區(3′-untranslated region，3′-UTR)結合，抑制靶 mRNA的翻譯過程[2]。基于這種機制，miRNA 參與了哺乳動物約50%的基因表達與調控，而且一個miRNA往往可以作用于多個mRNA，一個基因也可以由多種miRNA來控制表達。miRNA在循環、呼吸、內分泌、以及生殖等系統中都有著非常豐富的表達，參與機體正常的生理活動。在疾病的發生和發展中，部分miRNA則會出現表達異常的情況，這些異常將帶來一些病理變化，這標志miRNA檢測具有潛在臨床意義。

一、miRNA 參與精子發生

（一）miRNA在精子發生中的表達

精子發生可以被劃分為三個階段：二倍體精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）通過增殖分化形成精母細胞，精母細胞減數分裂形成單倍體精細胞，精細胞經變形形成成熟精子，精子發育成熟后會被儲存在附睪中。在 2 月齡與 6 月齡、6 月齡與 12 月齡和 2 月齡與12月齡的小尾寒羊睪丸組織中可以分別檢測出5個、1個和4個差異表達的已知的miRNA，以及132、105和24 個差異表達的未知miRNA[3]。小鼠SSCs 增殖分化時，miRNAs占總小RNA（total small RNAs）的19%，在減數分裂期間，最高會達到60%以上，減數分裂末期miRNAs 的量則會下降到小于5%，在成熟的精子中，miRNAs 的量約為40%。在小鼠的X-連鎖miRNAs（X-linked miRNAs）家族中有19個基因位于SLITRK 2，3 個基因位于FMR1，而在人類中14 個miRNA 基因位于SLITRK 2，17 個基因位于FMR1[4]。這些數據表明，在不同物種之間的miRNA 前體序列具有高度的同源性。而且miRNA 在睪丸組織發育的不同時期表達會有差異，在精子生成的過程中，miRNA 的表達也會有較大的差異。

（二）miRNA參與SSCs的調控

SSCs 的增殖分化是精子發生的第一步，miRNAs可以通過各種通路調控SSCs 的增殖和分化。細胞周期蛋白（Cyclin）包括Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1等，它們在調節細胞增殖的過程中至關重要。其中Cyclin B1 對于SSCs 的調控可能是通過Lin28a 和let-7 miRNA 實現的，敲除Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1基因會導致人SSCs增殖下降，而提高miR-663a可以通過靶向抑制轉錄因子NFIX，調控Cyclin A2、Cyclin B1 和Cyclin E1 的表達，來促進SSCs 分裂[5]。小鼠睪丸中miR-30a-5p的下調可能導致膠質細胞系源性神經營養因子受體α1（GFRα1）的降低。GFRα1的降低則可以通過阻斷GDNF/GFRα1/RET 信號通路，來促進SSCs 的自我更新[6]。支持細胞可以分泌的含有miR-486-5p 的外泌體，而SSCs中的miR-486-5p可以下調張力蛋白同源物基因（PTEN）和上調視黃酸刺激基因8（STRA8），這表明外泌體miR-486-5p可以通過PTEN/STRA8軸促進SSCs 的分化，抑制SSCs 我更新[7]。除上述miRNA之外，miR-322、和Hsa-miR-1908-3p 分別通過Ras相關結構域家族基因8（RASSF8）和Kruppel 樣轉錄因子2（KLF2）來調控SSCs的增殖和凋亡[8,9]。這些數據表明，SSCs自身產生的miRNAs和外泌體miRNAs均可以參與SSCs的生理活動并且發揮著重要作用。

（三）miRNA參與精母細胞減數分裂

減數分裂前和減數分裂過程中所表達的miRNA有所不同。如 miR-10，miR-10-iso，miR-181，miR-148和miR-143 等在生殖細胞中的表達會隨著減數分裂過程的進行逐漸減少。而miR-125、miR-15、miR-99、let-7、miR-143、miR-26、miR-127、miR-22 和 miR-30 等在減數分裂前表達增加，在精子細胞中的表達量會減少。在臨近精母細胞減數分裂時，miR-34、miR-191、miR-470 和 miR-871 家族的表達均會增加[10]。Wang 等學者通過對雞精子發生過程中STRA8（在調控減數分裂的起始中起著重要作用）的3′-UTR的miRNAs預測，構建了4 個miRNA，其中miR-31 可以直接靶向抑制STRA8 的表達從而抑制減數分裂的發生，隨后將Gga-miR-218的干擾載體轉染到雞的SSCs中后發現與減數分裂相關基因STRA8、DAZL、SYCP3、NANOS3和DMC1有不同程度的下調，后經驗證STRA8是GgamiR-218 靶點之一[11]。miR-29 家族是減數分裂中是一個重要的調節因子[10]：精母細胞中的miR-29 可以通過下調DNA 甲基轉移酶3A（DNMT3A）的表達，使小鼠精母細胞減數分裂前期I 期mRNA 的靶基因被廣泛抑制。目前研究顯示多種miRNAs參與到了精母細胞的減數分裂過程中，雖有部分調控機制被證實，但是其中大部分調控機制尚不明確，仍需實驗驗證。

（四）miRNA參與精細胞變形和附睪功能

精母細胞在第二次減數分裂末期形成單倍體精細胞，呈圓形，需要經過變形才能形成“蝌蚪”狀的成熟精子。在精子染色質濃縮變形的過程中，精細胞中的組蛋白被過渡蛋白（transition nuclear protein，TP）取代，在精細胞變長的時期，魚精蛋白（Promatine，PRM）會取代TP，在此過程中，PRM可以使染色質變得穩定，不易發生突變。在圓形精細胞中表達的miR-122a 可以通過調控TP2，參與到過渡蛋白取代組蛋白的過程中。而 miR-469 可以通過結合 TP2 和 PRM2 的 mRNA 編碼區，抑制TP2和PRM2蛋白表達，參與到精子變形的過程中。miR-888 也可以通過靶向控制精子相關抗原1和6（SPAG1、SPAG6）的表達，協助精子尾部的形成和結構的完整[12]。附睪是連接睪丸和輸精管的組織，成熟的精子會在附睪中儲存，并在此處進一步成熟，獲得運動能力。在羊的附睪頭和體之間有13個已知的miRNA 差異表達，頭和尾之間有29 個，體和尾之間有22個，其中let-7、miR-541-5p、miR-133b和miR-150可能在羊附睪精子成熟調控中發揮重要作用[13]。睪丸和附睪頭中由小管連接，這些小管中有類似輸卵管中的纖毛組織，在把精子從睪丸送到附睪的過程中起著重要的作用。滅活小鼠的miR-34b/c 和miR-449 后，小鼠出現了精子成熟障礙的表現，而且睪丸重量增加，連接睪丸和附睪頭的小管明顯增大[14]。而與人類初級纖毛運動障礙相關基因DNAH6 是miR-34b/c 和miR-449 的靶點。因此推測，miR-34b/c 和miR-449 可能通過參與纖毛的發生影響精子的成熟。

二、miRNA與雄性精子質量、胚胎發育

（一）miRNA在男性不育中的表達

在全球范圍內，約8-12%的夫妻患有不孕癥，并且有相當部分不孕癥患者的病因不明。而患有不孕癥的夫婦中，男性因素達到了50%。其中無精子癥（azoospermia）、少精子癥（oligospermia，OS）、弱精子癥（asthenozoospermia，AZS）和畸形精子癥是男性不育的重要精液表相。Salas[15]在對8例精子參數正常、但是女方無法受孕的男性精液進行分析，并與對照組比較后發現，共有57個miRNAs在群體中差異表達（45個表達上調，12個表達下調），針對這些miRNAs，共預測了8606 個靶基因。另一項研究發現，在不育男性中有5種miRNAs顯著上調，3種miRNAs表達下調，而且精子濃度與多種miRNAs 的表達水平（let-7a、miR-7-1-3p、miR-141、miR-200 A、miR-429）呈顯著負相關[16]。鑒于miRNA在精子發生過程中的重要作用，miRNA也許可以成為男性不育的診斷依據和生物學標志，在男性不育診治過程中起到作用。

（二）miRNA與無精子癥、少精子癥和弱精子癥

無精子癥患者可以分為梗阻性無精子癥（OA）和非梗阻性無精子癥（NOA）。有研究報道，在OA 與NOA患者的病例分析中發現hsa-miR-27a-3p的表達有顯著差異，在NOA 患者精液中其表達為上調，并可以通過靶向下調賴氨酸去甲基化酶3A（KDM3A）參與NOA 的發生[17]。Cito[18]檢測了 14 例 NOA 患者血漿中循環miR-20a-5p的表達，發現與正常人相比，其表達量顯著增高。而在NOA 患者睪丸組織中miR-10b-3p 和miR-34b-5p的組合對NOA的診斷具有較高的準確度，可以作為診斷男性不育的生物學標志物。外泌體miRNAs的分析可能成為檢測疾病或者判斷身體情況的一種新手段，檢測無精子患者精漿外泌體中miR-539-5p和miR-941的水平可以用于鑒定睪丸中是否有精子的存在[19]。運用這種方法可以在睪丸穿刺診斷NOA 前，給予醫生參考。miR-371 家族在生殖系統腫瘤中得到了大量的研究，多數學者認為miR-371 家族具有成為睪丸生殖細胞腫瘤的新血清標志物的潛力。也有學者發現miR-371-3p的表達與精子濃度和精子總數顯著相關，可以作為OS 的生物學標志物[20]。線粒體miR-17～92 的缺失可以破壞精子的發生：在僅敲除小鼠睪丸miR-106b～25 基因后，小鼠睪丸體積變小，表現為OS，但依然具有生育能力，而 miR-17～92 和 miR-106 b～25雙基因敲除的小鼠則表現為睪丸組織嚴重受損，生育能力明顯降低[21]。研究發現miRNA 在AZS 患者精液中的表達與正常人有差別，Heidary[22]在AZS 患者的精液里發現了18 種差異表達的miRNAs，其中miR-888-3p 的上調似乎與特發性AZS 有關。SEMG1是精子中一種重要的分泌蛋白，它參與了精子凝膠基質的形成。而AZS 患者SEMG1 基因的mRNA 和蛋白水平明顯高于正常人，并且miR-525-3p 可以與SEMG1 基因的 3′-UTR 結合，靶向調控 SEMG1 蛋白的表達[23]。不僅如此，AZS患者精液中的miR-135a-5p可以通過靶向抑制Janus激酶2（JAK2），從而影響精子活力[24]。線粒體相關miR-4485-3p 被發現在AZS 患者精液中表達下調，并且其三個靶基因（DNAH 1、KIT 和PARK 7）可能通過影響線粒體功能，涉及AZS 的病理機制[25]。

（三）miRNA與畸形精子癥和不良妊娠結局

精子貢獻了胚胎50%的遺傳物質，因此精子異常不但會影響受孕，而且還會影響到妊娠結局。精子的形態、膜的完整性、精子畸形率和精子DNA 完整性等因素異常是造成不良妊娠結局的重要因素。Gholami[26]用Westernblotting 方法檢測畸形精子癥患者miR- 582-5p和CRISP2（富含半胱氨酸的分泌蛋白，CRISPs）的表達量，發現miR-582-5p 在畸形精子癥患者的精液里表達上調，而CRISP2 的表達下降，之后又檢測畸形精子癥患者精液CRISP3 的表達，并且測定了靶向CRISP3的 4 個 miRNAs，發現有三 個 miRNA（miR-182-5p，miR-192-5p 和 miR-493-5p）有上調，并且 CRISP3 糖基化亞型的表達水平明顯低于正常人。推測miRNAs靶向調控CRISP2和CRISP3可能是畸形精子癥發病的一個機制。精子染色質和DNA 異常被認為是早期流產的原因之一。精子DNA碎片指數（DFI）是一個體現精子DNA完整度和受損程度的指標。在高DFI的精漿標本中 miR-374b 和 miR-26b 的表達會下降[27]，因此miR-374b 和miR-26b 可能是反映精子質量的指標，從而預測產婦的妊娠結局。

目前對于OA、NOA、OS 和AZS 的診斷依賴于精液分析，但是精液分析對于男性不育的指導價值有限，并不能完全反應男性真實的生育能力。大量研究表明miRNAs在精子質量異常的精液里的表達有顯著差異，可以作為生物學標記物參與到疾病的診斷中，但多數研究的重點是miRNAs的表達差異與OA、NOA、OS和AZS的相關性，對于具體調控機制的研究仍然不足。

（四）精源性miRNA與受精

通常認為人卵巢排出的卵子并未徹底完成減數分裂，還屬于初級卵母細胞，其在輸卵管內受成熟促進因子和細胞生長抑制因子的刺激發育到第二次減數分裂中期，而卵母細胞完成減數分裂就需要精子或者其他物質的作用才能進行，精子中所帶的這種物質被稱為精源性卵母細胞激活因子（sperm-borne oocyte activation factor,SOAF）。鈣離子振蕩是卵母細胞激活的一個重要機制，而磷脂酶 C-zeta（phospholipase C zeta,PLCz）作為卵母細胞鈣離子震蕩的重要調控因子現已被證實是SOAF 的一種，Schrimp R[28]在對漢諾威溫血馬的PLCz1 的基因經行測序后，發現在其基因內含子里含有miRNA 的基因序列，這說明miRNA 可能會參與到PLCz1的的表達，從而影響卵母細胞的激活。Li[29]在對比公豬新鮮的精子和獲能的精子后發現了12個差異表達的 miRNAs（8 個已知 miRNAs，4 個未知 miRNAs）可能通過PI3K-AKT、MAPK、cAMP-PKA 和鈣離子信號通路參與到精子的獲能過程中。由此可見精源性miRNAs可以通過調控其靶基因參與到激活卵母細胞和精子獲能的過程中，從而影響受精過程。

（五）miRNA與胚胎早期發育

在受精卵形成之后隨即開始分裂，從單個細胞變更成多細胞囊胚的過程中有著多種因素的調控，miRNAs在其中也發揮著重要作用。有研究發現，miR-449b[30]在精子中的表達明顯高于在卵子中的表達，在牛的1細胞胚胎、2 細胞胚胎和8 細胞胚胎時期，體外受精、體細胞核移植胚胎和孤雌激活胚胎之間的miR-449b表達并沒有顯著差別，并且精子攜帶的miR-449b 并沒有下降。后續研究發現miR-449b 的過表達增加了體細胞核移植早期胚胎的整體組蛋白乙酰化水平、延長了胚胎的第一次卵裂時間、降低了胚胎凋亡指數，并測得 CDK6、C-MYC、HDAC 1 和 BCL-2 均是miR-449b 調控對象，這些數據說明精源性miR-449b可以通過調控上述基因的表達參與早期胚胎的發育。Alves[31]在對有著不同受孕率的冷凍公牛精子中的miRNAs 分析后發現有9 個miRNA 的表達有差異（miR-205、-505、-532、-33b、-126-5p、-216b、-339a、-500和-542-5p），而且與 miR-216b 呈負相關的K-RAS 在兩細胞胚胎第一次卵裂和囊胚時期大量表達，由此推測精源性miR-216b 可能通過調控K-RAS 參與到牛胚胎早期的分裂。Qin[32]觀察了普通受精組、體細胞核移植組（NT-C 組）和注射了精子攜帶的miRNA 的體細胞核移植組（NT-T 組）兔子的胚胎發育情況，發現NT-C 組的組蛋白H3 水平顯著高于受精組和NT-T 組，NT-C 組的囊胚凋亡指數明顯高于受精組和NT-T 組，NT-C 組胚胎的總細胞數顯著低于受精組胚胎，注射精子攜帶的miRNA 可顯著增加體細胞核移植囊胚的總細胞數。用精子介導的pLenti-III-GFP-miR-Off-Let-7a載體處理獲得的卵母細胞經激活發育后，可以檢測到卵母細胞中 miR-Let-7a 的表達降低、Toll 樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）在基因和蛋白質水平上表達較高、并且觀察到滋養層細胞向子宮內膜細胞的附著和遷移顯著增加，這說明miR-Let-7a 通過調控TLR4，參與到胚胎的著床過程[33]。先前的實驗發現精源性miR-34c 是小鼠受精卵第一次分裂不可或缺的調控因素，而后另一篇報道發現miR-34b/c 和miR-449 是精子發生所必須的，但不是在受精或者胚胎發育之前不可缺少。造成矛盾結果的原因可能是先前的研究使用的是miR-34c的抑制劑，而且 miR-34c 屬于 miR-34a、miR-34b/c 和miR-449a/b/c 家族，它們擁有相同的 3′-UTR 識別種子序列，因此它們都是功能冗余的，家族中的一個失活不會影響表型[34]。miRNAs 在胚胎發育過程中的研究主要以母體產生的miRNAs 和胚胎發育過程中出現的miRNAs為主，對于精子攜帶的miRNAs在這一鄰域的研究還處于起步階段，而且部分功能和調控機制還存在爭議，仍然需要學者繼續努力。

總結與展望

男性不育病因目前尚未完全明確，因此男性不育的治療也難以展開。已有的研究表明，精液質量是引起男性不育的重要因素，精子在發生過程中出現異常將會極大的影響精液質量。目前已有大量學者們發現了眾多與調控精子發生和男性生育相關的miRNAs差異表達和調控通路，包括調控SSCs的增殖分化、減數分裂、精細胞變形和附睪功能，其中差異表達的miRNAs可以做為生物學標志為醫生提供參考。發現更多miRNAs在其中的作用有助于明確男性不育的病因，為診斷和治療提供新思路。由于精子攜帶的miRNAs 在受精及胚胎的早期發育過程也起著重要作用，異常的精源性miRNAs也會導致胚胎發育異常，甚至造成流產等不良妊娠結局。胚胎發育異常被認為是流產的主要因素之一，但依然有一半的流產病因無法確定，深入研究精源性miRNAs在胚胎發育過程中的作用機制有助于了解流產的病因，從而探討新的預防、診斷和治療的方法。