勃起功能障礙患者海綿體CYS/H2S通路相關(guān)基因表達(dá)及其影響機(jī)制研究

賀 臘 李毓龍 余松川

四川省簡陽市人民醫(yī)院檢驗科（四川 簡陽 641400）

勃起功能障礙(ED)的特征是在性活動期間無法實現(xiàn)或維持足夠的勃起硬度來完成滿意性生活[1]，往往伴有高血壓、冠狀動脈粥樣硬化和糖尿病等[2]。估計到2025年全球?qū)⒂?.22 億男性患有ED[3]。海綿體內(nèi)皮參與海綿體平滑肌細(xì)胞松弛這一生理現(xiàn)象，有助于勃起功能的啟動和維持[4]。H2S（硫化氫）信號已被證實參與勃起生理學(xué)反應(yīng)，并且在動物實驗中被證明可松弛海綿體并增強(qiáng)其勃起功能[5]。H2S 由CYS（半胱氨酸）通過胱硫醚γ-裂解酶(CSE)和胱硫醚β-合酶(CBS)的酶活性內(nèi)源形成，這兩種酶已被發(fā)現(xiàn)在人陰莖海綿體和血管中功能性表達(dá)[6]。最近，有研究證明H2S 及CYS能通過涉及cGMP 積累的機(jī)制松弛勃起功能障礙患者的陰莖海綿體和陰莖動脈[7]。陰莖平滑肌松弛通路的改變會阻礙與勃起有關(guān)的血流動力學(xué)過程并導(dǎo)致ED，ED的常規(guī)治療涉及通過抑制5 型磷酸二酯酶(PDE5) 來增強(qiáng)NO/cGMP 途徑，但存在部分患者對這種治療策略沒有反應(yīng)。筆者就此進(jìn)行研究，探究勃起功能障礙患者海綿體CYS/H2SmRNA 表達(dá)及其影響機(jī)制，旨在為此類患者治療尋找新靶點提供一定依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、材料

樣本來源 研究樣本來自我院2016年-2021年無勃起功能障礙陰莖延長術(shù)患者24例（對照組）及同期接受陰莖假體植入患者24例（研究組），患者及其家屬均知情并同意參與研究，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，簡醫(yī)倫審2021029，取患者陰莖組織，保存在4-6°C的滅菌M-400 溶液中（每100 毫升的組成：甘露醇，4.19 克；KH2PO4，0.205 克；K2HPO4·3H2O，0.97 克；KCl，0.112 克；NaHCO2，0.07.08 克）待測。

主要試劑 免疫熒光染色試劑盒（南京凱根生物科技有限公司）；酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）；山羊抗小鼠β-actin、Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗購自北京百奧萊博科技有限公司等。

主要儀器 DM 750 型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；Spectra Max M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices 公司）；RM2235 型石蠟切片機(jī)（德國Leica公司）；定量PCR 儀器（賽默飛世爾科技）；全自動免疫分析儀（美國雅培制藥）等。

二、方法

（一）海綿體組織（human corpus cavernosum，HCC）的功能評價

將海綿體組織條帶(3×3×7 mm) 浸入8 mL 含有Krebs-Henseleit 溶液的器官室中，該溶液由以下成分(mM) 組成：NaCl 119、KCl 4.6、CaCl2 1.5、MgCl2 1.2、NaHCO324.9、葡萄糖 11，KH2PO4 1.2，EDTA 0.027；在37℃下用95%O2/5%CO2混合物連續(xù)鼓泡以保持pH值為7.4，用于如前所述的等長張力記錄（MartínezSalamanca 等人，2015 年；La Fuente 等人，2019 年）。1 μM去氧腎上腺素(PE)的最大收縮反應(yīng)下降每個組織條逐漸拉伸到最佳等長張力。然后將制劑暴露于高K+濃度(125 mM)并測量收縮反應(yīng)，并通過觀察NaHS 或CYS表達(dá)來評估松弛反應(yīng)。

（二）蛋白質(zhì)印跡分析

從HCC 中提取總蛋白質(zhì)樣品。HCC 組織用預(yù)冷的組織裂解液勻漿，4℃12,000 rpm 離心15 分鐘，取上清液。使用BCA 蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。將等濃度的蛋白質(zhì)裂解物加載到10%十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳上，電泳80 V 30 分鐘和120 V 60 分鐘，然后電轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜。用5%脫脂奶粉室溫封閉膜1h。然后，將膜與CaSR、PLC、PKCδ、JNK，p38，Bax，GAPDH 抗體 4℃過夜，然后清洗膜并與適當(dāng)?shù)睦备^氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育1 小時。最后使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)（Clinx Science Instruments, U.S.A.）觀察蛋白質(zhì)條帶。測量β-actin 表達(dá)水平作為內(nèi)源參考并用于標(biāo)準(zhǔn)化。根據(jù) 2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)。

（三）cGMP含量的測定

使用NaHS(1 mM)或CYS(1 mM)5 分鐘后，立即將HCC 條浸入液氮中冷凍并儲存在-80°C 直至提取環(huán)核苷酸。組織在6 次均質(zhì)中提取%三氯乙酸，然后用乙醚（H2O 飽和）萃取并凍干。使用ayman Chemical Company 的試劑盒，通過酶聯(lián)免疫吸附測定法測定cGMP 的濃度，試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

（四）免疫熒光檢測

將 HCC 浸入蔗糖（30% w/v）中，嵌入包埋劑（optimum cutting temperature，OCT）中并儲存在-80°C下。OCT 塊在低溫恒溫器中切片。用丙酮處理去除OCT，用含有 2%BSA 的 PBS 封閉 30 分鐘，然后與兔抗體抗人CBS（1∶200 稀釋）和 CSE（1∶100 稀釋）在4°C 下孵育過夜。PBS 洗滌后，將切片與二級Alexa Fluor 488 偶聯(lián)山羊抗兔抗體孵育45 分鐘在室溫下和300 nM 二脒基-2-苯基吲哚在室溫下復(fù)染細(xì)胞核5 分鐘。切片安裝并通過熒光顯微鏡觀察。

（五）CYS、H2S水平檢測

取 HCC 組織制成勻漿，3000r/min 離心 20min，取上清液，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測。試劑盒分別為CYS Elisa檢測試劑盒，購自默克生物；H2S Elisa檢測試劑盒購自武漢塞培生物。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、ED患者CYS/H2S 通路受損

研究組患者HCC 組織中CYS、H2S 水平顯著低于對照組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 兩組CYS、H2S水平比較()

二、ED與人海綿體對CYS/H2S 通路介導(dǎo)的松弛反應(yīng)降低有關(guān)

研究組患者HCC 中NaHS及CYS的 pEC50、Emax顯著降低（P＜0.05），NaHS 的Emax無顯著變化（P＞0.05）。ED 與CYS、NaHS 誘導(dǎo)的HCC 松弛反應(yīng)降低顯著相關(guān)見表1，圖2。

表1 兩組pEC50、Emax比較（）圖中第二條橫線中間

表1 兩組pEC50、Emax比較（）圖中第二條橫線中間

組別對照組（n=24）研究組（n=24）CYS NaHS t P pEC50 4.92±0.25 3.83±0.19 17.006 0.000 Emax（%）68.04±5.53 47.18±4.26 14.640 0.000 pEC50 4.84±0.21 4.07±0.16 14.288 0.000 Emax（%）95.25±8.04 87.57±7.55 3.411 0.001

圖2 相關(guān)性分析曲線

三、ED患者的HCC中CYS及NaHS產(chǎn)生cGMP的能力降低

研究組患者HCC中CYS及NaHS誘導(dǎo)的cGMP表達(dá)顯著低于對照組（P＜0.05），見圖3。

圖3 兩組產(chǎn)生cGMP能力比較（）

四、ED患者Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達(dá)變化

研究組患者HCC中Bax、Caspase-3蛋白相對表達(dá)顯著高于對照組，Bcl-2蛋白相對表達(dá)顯著低于對照組（P＜0.05），見（圖4a和圖4b)。

圖4 兩組Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達(dá)

五、ED 患者 HCC 中 H2S 合成酶 CSE 和 CBS 表達(dá)降低

免疫熒光檢測結(jié)果顯示，相較對照組，研究組HCC中CSE和CBS表達(dá)減少。見圖5。

圖5 兩組免疫熒光檢測結(jié)果

討 論

近年來，ED 發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢，嚴(yán)重影響男性身心健康。盡管目前已有包括基因治療、干細(xì)胞移植、5-磷酸二酯酶(PDE5)抑制劑和低能量沖擊波治療ED新途徑[8]。然而ED發(fā)病機(jī)制尚未闡明，仍有部分患者療效不夠理想。最近有研究報道了通過對來自ED患者陰莖組織外源性添加穩(wěn)定的H2S 類似物(NaHS)或CYS促H2S產(chǎn)生導(dǎo)致HCC)松弛和陰莖動脈(HPRA)的血管舒張[9-10]。進(jìn)一步證實了CYS/H2S 通路驅(qū)動陰莖血管組織松弛的能力。

本研究創(chuàng)新性在于，筆者發(fā)現(xiàn)ED 患者病情發(fā)生發(fā)展與其HCC 和HPRA 中CYS/H2S 信號傳導(dǎo)受損具有密切聯(lián)系。從這個意義上說，ED 中CYS/H2S 途徑的主要改變是由內(nèi)源性H2S 產(chǎn)生介導(dǎo)的功能反應(yīng)受損。事實上，NaHS 誘導(dǎo)的松弛在HCC 中受到ED 的輕度損害，由CYS 誘導(dǎo)的松弛/血管舒張顯然比由外源性添加的H2S 類似物誘導(dǎo)的反應(yīng)更受ED 的影響。Aydinoglu 等[11-12]發(fā)現(xiàn)用氨氧乙酸和炔丙基甘氨酸抑制H2S 合成酶會減弱CYS 在小鼠和人類陰莖組織中的松弛能力，證實CYS 誘導(dǎo)的松弛需要內(nèi)源性產(chǎn)生H2S。此外，本研究也顯示來自ED 患者的HCC中CYS 誘導(dǎo)的松弛顯著減少，與其結(jié)果基本相符。cGMP 信號在人類和動物陰莖組織以及其他組織中的參與勃起功能調(diào)節(jié)[13]。人陰莖組織中與ED 相關(guān)的CYS/H2S 通路的功能障礙與CYS 誘導(dǎo)ED 患者HCC 中cGMP 積累的能力顯著降低一致。分析cGMP 測定表明ED 患者的海綿體組織中H2S 的產(chǎn)生功能失調(diào)，而不是該氣體遞質(zhì)刺激cGMP 積累的功效降低，因為未檢測到NaHS增加這些組織中cGMP 的能力顯著降低。H2S 還是一種細(xì)胞凋亡調(diào)控因子，有研究指出其可通過抑制caspase-3表達(dá)提高細(xì)胞活性，減少細(xì)胞凋亡[14]。但其是否參與海綿體細(xì)胞損傷引起ED 尚未得到證實。細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞環(huán)境動態(tài)平衡的基本程序性細(xì)胞死亡過程。Bcl-2家族由抗凋亡蛋白Bcl-2 和促凋亡蛋白Bax組成。Bcl-2 是著名的具有代表性的凋亡抑制因子，而Bax 可以與Bcl-2 結(jié)合形成異源二聚體，拮抗Bcl-2對細(xì)胞凋亡的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。另一方面，Bax 還激活caspase-3，促進(jìn)Ca2+釋放，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Caspase-3 作為代表性的執(zhí)行者在細(xì)胞凋亡中起著舉足輕重的作用。因此，Bax、Bcl-2和caspase-3水平被認(rèn)為是評價細(xì)胞凋亡的指標(biāo)。本研究結(jié)果可見，研究組患者HCC 中Bax、Caspase-3 蛋白相對表達(dá)顯著高于對照組，Bcl-2 蛋白相對表達(dá)顯著低于對照組（P＜0.05）。提示ED 患者CYS/H2S 通路損傷可能引起ED。

此外，在內(nèi)皮動脈平滑肌中均檢測到CBS 和CSE的表達(dá)。然而，Aydinoglu 等[15]指出在小鼠海綿體中，H2S 產(chǎn)生CYS 具內(nèi)皮依賴性。雖然最初認(rèn)為H2S 僅由血管平滑肌細(xì)胞合成，但后來證明它也可以由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，并在內(nèi)皮血管舒張中起重要作用[16]。蛋白質(zhì)硫化被認(rèn)為是內(nèi)源性硫化氫對內(nèi)皮功能影響的機(jī)制，無論精確的分子機(jī)制如何，目前的結(jié)果都與內(nèi)皮功能和內(nèi)源性硫化氫生成的血管舒張能力之間的聯(lián)系一致，本研究中 ED 與 CYS、NaHS 誘導(dǎo)的 HCC 松弛反應(yīng)降低顯著相關(guān)這一結(jié)果也對其進(jìn)行了證實。ED 患者海綿體組織中兩種主要H2S 合成酶表達(dá)的顯著降低可以解釋與健康組織相比，這些組織中CYS/H2S 通路的功能受損。免疫熒光檢測顯示ED患者的HCC中CBS和CSE表達(dá)均顯著降低，這表明CYS誘導(dǎo)的陰莖血管組織松弛的缺陷可能是由于CBS和CSE的表達(dá)受到抑制。這些酶的表達(dá)降低會導(dǎo)致暴露于CYS后H2S的可用性降低，cGMP 積累減少，從而導(dǎo)致 ED 患者 HCC 松弛減弱。

本研究不足：盡管根據(jù)目前的數(shù)據(jù)，以上推論及分級是合理的，但應(yīng)該注意的是，本研究報告的CYS 誘導(dǎo)的松弛受損與CBS 和CSE 下調(diào)之間的關(guān)系僅具有關(guān)聯(lián)性，缺乏操縱酶表達(dá)的因果證據(jù)。目前數(shù)據(jù)的另一個不足是缺乏海綿體組織中H2S 測量，此外，現(xiàn)在人們普遍認(rèn)為，H2S 的產(chǎn)生會導(dǎo)致心血管疾病的血管功能障礙[17]，從這個意義上說，在高血壓動物模型中已經(jīng)報道了CBS和CSE血管表達(dá)降低。此外，導(dǎo)致CBS或CSE表達(dá)降低的小鼠基因敲除已被證明會導(dǎo)致內(nèi)皮依賴性松弛缺陷和血壓升高，同時，在患有ED 的糖尿病大鼠的海綿體組織中，觀察到CBS 和CSE 表達(dá)但活性較低[18-19]，但需要進(jìn)一步證實其在人體組織中變化趨勢及作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

綜上所述，ED患者的海綿體組織和陰莖動脈顯示出受損的CYS/H2S 介導(dǎo)的海綿體平滑肌松弛和cGMP積累，這與這些組織中H2S合成酶、CBS和CSE的表達(dá)降低有關(guān)，其可能通過影響患者正常海綿體松弛及海綿體細(xì)胞凋亡影響患者勃起功能。