葉酸含量測定在食品生物化學實驗教學中的實踐

嚴慧玲， 郭新波， 劉金釧

（華南理工大學輕工與食品國家級實驗教學示范中心，廣東 廣州 510640）

0 引言

培養具有創新意識和創新能力的高素質人才，是目前各高校人才培養的共同追求。在人才培養的過程中，實驗教學是其中的重要組成部分。通過實驗教學，可以培養學生發現及解決問題的能力，激發其創新意識，養成嚴謹的科學態度。在提高學生學術綜合素養的同時，實現高等教育內涵發展，提升人才培養質量， 強化學生實踐能力和創新思維的目標。

由于學時有限等原因，實驗課程內容安排欠合理是目前本科實驗教學面對的一大難題。為了完成教學內容安排，大部分高校的實驗課程按照“一門實驗跟一門課程”的模式進行教學。如《食品微生物實驗》對應《食品微生物學》課程，主要講述食品中微生物各項指標的檢測。此外，不同實驗課程的教學內容比較孤立，各實驗項目之間相互獨立。即使是綜合性實驗，綜合的一般都是本門理論課程中的各個知識點，與其他課程的內容交叉甚少甚至完全獨立[1]。

為了提高實驗課的教學效果，鞏固學生所學的知識，讓學生熟悉與掌握實踐性較強的技術，在食品生物化學實驗課程中引入科研實驗室常用的葉酸含量測定實驗，同時融合了微生物相關的知識點。旨在通過葉酸含量測定的實驗，將維生素的性質、酶的應用、微生物培養等知識內容結合在一起，從葉酸的提取、菌種活化到接種、培養、含量測定，將食品生物化學實驗課重新編排，以葉酸的提取及含量測定作為教學模塊，形成具有連貫性的教學內容。

1 葉酸含量測定綜合性實驗設計

1.1 基本思路

食品生物化學實驗是食品專業本科生重要的專業基礎課，根據專業培養目標及課程設置要求，針對營養類綜合性設計性實驗進行了探索和實踐[2-3]。基本思路：以建設食品科學一流學科為目標，更多地體現學科特色，充分考慮到課程的銜接性和延續性，盡可能將零散的知識點串聯在一起，綜合目前科研實驗室常用的實驗方法和技術，激發和培養學生對本專業的熱情及科研參與積極性，增強學生靈活應用理論知識解決實際問題的意識和能力。

葉酸含量測定的綜合性實驗涵蓋了微生物學、分析化學、食品生物化學3 門課程。由于實驗涉及的知識點較多，為使學生能夠更好地理解操作步驟，將對應知識點進行歸納總結，如表1 所示[4-5]。

表1 實驗步驟及對應知識點Tab. 1 Experimental steps and knowledge points

1.2 菌種的選擇

酪乳酸桿菌（ATCC 7469） 、糞鏈球菌（ATCC 8043）是葉酸需求菌，其生長狀況和所處環境中葉酸的含量高低具有極強的相關性[6-7]。在一定條件下，酪乳酸桿菌和糞鏈球菌的繁殖速度與葉酸含量呈正比關系，細菌增殖的量以吸光度值計，通過與標準曲線相比較，能計算出樣品中葉酸的含量。國標GB 5 009.211－2014采用酪乳酸桿菌（ATCC 7 469）作為檢測菌，但因其檢測限低、培養時間長，不適合用于本科教學，故選用糞鏈球菌作為本實驗的葉酸檢測菌[8-10]。

2 實驗安排

考慮到本科實驗的難度及深度，葉酸含量測定綜合性實驗在本科第4 學期開設。此時學生已完成分析化學、有機化學、無機化學、微生物等課程的學習，具有一定的實驗基礎。為了保證實驗順利進行，讓學生從基礎性實驗到綜合性實驗有一個較好的過渡，將葉酸含量測定綜合性實驗設置為半開放實驗：即將實驗分成兩部分，葉酸的提取為開放部分，由學生自行查找文獻以確定方法；葉酸含量的檢測為給定部分，教師提供既定的方法。實驗室根據學生的實驗方案向其提供實驗所需的試劑及設備。

2.1 實驗材料及試劑

市面上常見果蔬、谷物類及營養強化劑型樣品均可，材料由學生自帶。

實驗用菌種：糞鏈球菌（Streptococcus faecalis, S.F.ATCC 8 043）。

提供學生實驗方案涉及的所有試劑。

2.2 實驗步驟

2.2.1 檢測菌懸液的制備

菌種的復蘇：從甘油管中挑取小部分菌液，用平板劃線法得到單菌落；用接種環挑取ATCC8043 平板上一顆單菌落，接種至裝有30 mL 已滅菌的腦心浸液肉湯培養基的50 mL 無菌離心管中，輕輕旋上蓋子，置于37 °C 搖床培養4 h 至肉眼可見溶液變渾濁即可。

菌懸液的制備：菌種復蘇完畢后，8 000 r/min 離心2 min，在無菌環境中，倒去上清液，添加30 mL 0.85%無菌生理鹽水，重懸菌體，8 000 r / min 離心2 min。重復以上步驟3 次以清洗菌體，最后加入一定量的生理鹽水重懸菌體，在660 nm 下調整光密度至0.8 左右，即得到實驗用菌懸液，需現配現用。

2.2.2 葉酸的提取

常用的葉酸提取方法包括單酶法和三酶法[11-16]。針對不同的食品種類，葉酸的提取方法略有不同，此部分設置為開放實驗，樣品的預處理及提取由學生自行查閱文獻確定，教師提供其所需試劑。為消除試劑本身所含葉酸對實驗結果的影響，按照同樣的提取方法準備一支空白管，樣品部分以等質量的超純水代替。

1.1.1 細胞 SiHa、Hela、MS751人宮頸癌細胞、HcerEpic人正常子宮頸上皮細胞，均購自中國科學院上海細胞庫。

2.2.3 葉酸含量的測定

（1）標準曲線的繪制。

取15 mL 離心管按照0～9 號進行標記，向每支管中分別加入5 mL 葉酸測定培養基，于0～9 號管分別加入葉酸標準工作液（2 ng/mL）：0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、1.75、2.00、2.50 和3.00 mL，用超純水補至5 mL，于121 °C 滅菌20 min 后冷卻，在無菌操作的條件下，吸取50 μL 生理鹽水菌懸液至每支測定離心管中，于37 °C 搖床中培養18～20 h。將培養完畢后的離心管置于4 °C 冰箱中靜置15～30 min。以0 號管為參比，于660 nm 處測量吸光值，記錄數據。以標準系列管中葉酸含量為自變量（x），吸光度值為因變量（y），繪制標準曲線。

（2）測定。

取15 mL 離心管分別標注樣品管及空白管，每孔分別加入5 mL 葉酸測定培養基，于樣品管、空白管分別加入100 μL 樣品提取液（實際加樣體積應按照樣品具體情況進行調整）、100 μL 空白對照提取液（具體體積應與樣品管相等），用超純水補至5 mL。接種及培養方法同上。測各樣本生長后在660 nm 處的吸光值，由標準曲線換算樣品中葉酸含量。

2.3 結果計算

試樣中葉酸含量計算公式為

3 具體實施及經驗總結

不同于以往的實驗，葉酸綜合性實驗知識點較多且實驗的連貫性強，若實驗操作的其中一個環節出現紕漏，則容易導致實驗結果誤差大，甚至失敗。所以教師在實驗過程中的引導作用尤為重要，具體流程如圖1所示。

圖1 實驗流程Fig. 1 Experimental process

為了取得更好的教學效果，采取小班分組的方式進行教學，每個教師指導3～4 組學生，學生以2 人為單位組成一個小組，單獨完成實驗報告。為了讓實驗更連續，摒棄了“一周一次課，一次4 學時”的傳統教學時間安排，改為連續的“兩天12 學時”的時間安排，讓學生更多地參與實驗過程。由于本項目支持學生重復實驗，若學生無法在規定時間內完成，則可以在課后與教師預約，另行安排時間完成。

在樣品的選擇上設置了開放環節，由學生根據自己的興趣自帶樣品進行實驗，如西紅柿、奶粉、維生素強化劑等。如何對樣品進行預處理，稱取多少樣品進行實驗，這些都需要學生查閱文獻后確定。實驗室給每組學生提供試劑，而溶液的配制及樣品的處理均由學生自行完成。

比較學生繪制的標準曲線，發現以半開放形式開展本實驗，得到的數據具有較好的穩定性。以標準系列管中葉酸含量為x值， 吸光度值為y值，繪制一階方程得到R2>0.960 的標準曲線；按照唐靚等[16]的方法繪制4 階方程，則R2≥0.999，線性擬合良好。

實驗完成后，要求學生以小論文的形式提交報告，撰寫嚴格按照華南理工大學本科畢業論文格式的要求。小論文的撰寫需要學生查閱大量的文獻，累計一定的知識，形成自己的實驗思路。除了課堂上的有限學習時間，促使學生充分利用課后時間，改變應試教育模式，讓學生學以致用，擴大知識面。教師以引導者的身份引導學生完成整個實驗，及時解答學生在實驗過程中出現的各種問題，通過提問的方式啟發學生找到問題原因，并解決問題。不同于其他實驗，本實驗過程允許出錯，支持學生重復實驗，培養學生養成鍥而不舍的科研精神。

4 結束語

自2018 年開始在本科食品生物化學實驗教學中實施以來，葉酸含量測定綜合性實驗獲得了學生的一致好評。因該實驗項目與現實生活貼近，實驗選材為生活中常見的食品，學生表現出較高的興趣，大大提高了學習的主動性。以學生為主、教師為輔的教學模式，充分鍛煉了學生的創新意識和探索精神。學生自行組隊，查閱相關文獻，獨立提出實驗方案和實驗計劃，自主實驗、分析實驗數據，并撰寫實驗論文。連貫性較強，避免了基礎性實驗存在的知識點分散等問題，讓學生對實驗的整個流程更加清晰，有利于其對現行檢測方法的掌握。小班教學、小組配合，可以加深學生對基礎理論知識的理解，提高基本實驗技能，增強分析問題、解決問題的能力，培養嚴謹的科學思維方法、逐步建立探索創新意識，又能培養團隊合作精神，為今后進入科學研究領域奠定堅實的基礎。

該實驗方法簡單，對設備要求不高，但綜合性強，具有一定的廣度及深度，適合作為食品專業的綜合性實驗在各高校中開展。