miR-125b-5p、miR-122-3p的表達水平對乙型病毒性肝炎治療效果的預測

張省委,林 博,韓 冉,張萬宇

北京中醫藥大學東方醫院檢驗科，北京 100078

慢性乙型肝炎(HBV)是臨床常見的傳染病之一，隨著疾病的進一步進展，可逐步發展為肝硬化、肝癌以及終末期肝病[1]。目前，臨床通過對慢性HBV患者的抗病毒治療，可顯著降低疾病的進展。常見的抗病毒治療藥物主要包括干擾素以及核苷酸類似物，臨床研究發現，通過對慢性HBV患者采取干擾素治療，可獲得較高的乙型肝炎E抗原(HBeAg)以及乙型肝炎表面抗原(HBsAg)血清轉換率[2]，但是具有較高的不良反應，同時其較高的價格導致患者的依存性較低[3]。微小核苷酸主要存在于真核細胞生物以及病毒中。有研究報道顯示，miR-125b-5p、miR-122-3p不僅對于乙型肝炎的診斷具有積極的意義，同時在一定程度上對HBV的耐藥性判斷具有一定價值[3]。本文主要通過研究miR-125b-5p、miR-122-3p的表達水平，來探討其與HBV患者肝功能、免疫功能的關系，同時對治療效果進行預測分析，為臨床診斷以及治療效果監測提供科學依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 本文采取前瞻性研究，選擇2019年1月至2021年1月在本院進行HBV治療的120例患者為病例組，其中男66例，女54例；年齡39～59歲，平均(44.72±2.37)歲，病程2～4年，平均(3.01±0.22)年；平均體質量指數(BMI)為(24.11±2.09)kg/m2。HBV的診斷參考《慢性乙型肝炎診斷標準(2015年版)》[4]中對病毒性肝炎的診斷標準。納入標準：(1)滿足上述診斷者；(2)入組前2周未使用抗病毒或免疫抑制劑。排除標準：(1)對本研究藥物過敏患者；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)自身免疫性疾病患者；(4)精神障礙患者；(5)嚴重的心、腦、腎功能障礙患者；(6)惡性腫瘤患者。另選取同期體檢健康者120例作為對照組，其中男60例，女60例，年齡38～57歲，平均(44.82±1.89)歲；平均BMI為(24.01±1.99)kg/m2，排除標準：(1)HBV陽性指標者；(2)哺乳期或妊娠期婦女；(3)自身免疫性疾病；(4)精神障礙患者；(5)嚴重的心、腦、腎功能障礙患者；(6)惡性腫瘤患者。兩組患者的一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。所有患者均簽署知情同意書，并經本院醫學倫理委員會論證通過。

1.2方法

1.2.1治療方法 所有患者均采取富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(成都倍特藥業股份有限公司，國藥準字： H20163436,每日1次，每次300 mg)聯合恩替卡韋(安徽貝克生物制藥有限公司，國藥準字H20100019；每日1次，每次0.25 mg)治療，共治療6個月。治療結束后每3個月對患者進行定期隨訪，隨訪結束日期為2021年11月1日。隨訪指標包括肝功能檢測、HBV-DNA、HBsAg和乙型肝炎表面抗體(HBsAb)的檢測,根據結果統計術后HBV復發率。患者的治療效果評價標準：治療后患者的肝功能指標恢復正常狀態，HBV-DNA含量下降到<1 000 copy/mL則為顯效；治療后患者的肝功能指標明顯恢復，HBV-DNA含量較治療前降低值>2 000 copy/mL則為有效；治療后患者的肝功能指標無顯著變化，與治療前相比，HBV-DNA含量降低值<2 000 copy/mL則為無效。本研究中以120例HBV治療患者中顯效以及有效作為治療有效組，以無效作為治療無效組[5]。

1.2.2miR-125b-5p、miR-122-3p檢測 分別于治療前以及治療6個月后進行靜脈采血4 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，以Trizol試劑(TIANGEN,中國)進行總RNA提取，采用7500實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)進行擴增，miR-125b-5p上游引物：5′-TTA TTG GGT GTT GTA TT-3′，miR-125b-5p下游引物：5′-TTG TAG GGT TTG AGG TAT TT-3′，miR-122-3p上游引物：5′-GTA TTG GAT ATG ATT GAT TAT G-3′，miR-122-3p下游引物：5′-TAG TGT AGG GTT TGA GG-3′，以U6作為內參基因，U6上游引物，5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′，下游引物5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。反應條件設定為95 ℃下5 min，95 ℃下40 s，60 ℃下20 s，72 ℃下15 s，共計完成40個循環。使用2-ΔΔCt計算miR-125b-5p、miR-122-3p水平，ΔCt=各組目的基因Ct值-組內相應內參的Ct值，ΔΔCt=實驗ΔCt-對照ΔCt。

1.2.3肝功能檢測 采集所有患者靜脈血4 mL，3 500 r/min離心15 min后分離血清，采用全自動生化分析儀combas701檢測肝功能丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)和總膽紅素(TBIL)水平。ALT、AST和AST檢測試劑盒購于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照說明書嚴格操作。

1.2.4免疫指標檢測 使用流式細胞儀(FACSCalibur)對兩組患者的CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平進行檢測；使用全自動免疫分析儀combas801對兩組患者的IgA、IgM、IgG進行檢測。CD3+、CD4+、CD8+抗體購于賽默飛世爾公司；IgA、IgM、IgG檢測試劑盒購于南京Boxbio生物科技有限公司，所有操作均按照說明書嚴格操作。

2 結 果

2.1病例組與對照組的miR-125b-5p、miR-122-3p水平比較 病例組miR-125b-5p、miR-122-3p水平均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 病例組與對照組miR-125b-5p、miR-122-3p水平比較

2.2病例組與對照組的肝功能比較 病例組TBIL、ALT、AST均顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 病例組與對照組的肝功能比較

2.3病例組與對照組的免疫功能比較 病例組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG均顯著低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 病例組與對照組的免疫功能比較

2.4不同治療效果的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比較 經過富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯合恩替卡韋治療后，無效組的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平均顯著高于有效組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同治療效果患者的miR-125b-5p、miR-122-3p、HBV DNA水平比較

2.5不同治療效果患者的肝功能比較 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯合恩替卡韋治療后，無效組患者的TBIL、ALT、AST顯著高于有效組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 不同治療效果患者的肝功能比較

2.6不同治療效果患者的免疫功能比較 富馬酸替諾福韋二吡呋酯片聯合恩替卡韋治療后，無效組CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG顯著低于有效組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表6。

表6 不同效果患者的免疫功能比較

2.7相關性分析 通過對病例組miR-125b-5p、miR-122-3p與肝功能、免疫功能相關性分析，發現miR-125b-5p、miR-122-3p與TBIL、ALT、AST、HBV DNA呈正相關，與CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、IgA、IgM、IgG呈負相關，見表7。

表7 相關性分析

2.8miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標聯合檢測價值分析 miR-125b-5p、miR-122-3p對于患者治療無效預測的特異度顯著高于單獨檢測，且經ROC曲線分析，兩指標聯合檢測對于無效患者的預測ROC曲線下面積顯著高于單獨檢測，且miR-125b-5p、miR-122-3p最佳臨界值分別為2.41，2.55(2-ΔΔCt)。見表8和圖1。

表8 miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標聯合檢測價值分析

圖1 ROC曲線分析

3 討 論

人體感染HBV后，microRNA可受到損傷，分解后進入血液循環，其形態較為穩定[6]。有研究顯示，microRNA參與了肝細胞的炎癥反應以及氧化應激反應過程，因此檢測HBV患者的microRNA，對于探索疾病進展以及治療效果具有積極的意義[7]。

在本研究中，通過對HBV患者的miR-125b-5p、miR-122-3p水平分析，發現HBV患者體內miR-125b-5p、miR-122-3p水平高于健康人群，且隨著HBV患者治療效果的好轉呈現下降趨勢。miR-122-3p主要來源于人體的18號染色體。研究證明[8]，miR-122-3p在HBV感染過程中發揮重要的作用，在huh7肝細胞中miR-122-3p表達呈現上升趨勢，同時miR-122-3p與HBV的復制相關[8]。有研究發現，miR-122-3p可與HBV RNA非編碼區的59號位點相結合，進一步促進病毒的復制[9]。miR-122-3p還可以增加HBV的穩定性，在一定程度上促進疾病的進展。羅丹等[10]通過對HBV患者的疾病進展進行研究，發現患者的疾病進展與miR-122-3p呈現顯著的相關性，與本研究結果一致。

miR-125b-5p可通過抑制肝細胞內病毒的復制能力來降低病毒的感染作用[11]，而隨著患者肝細胞的損傷，細胞內的miR-125b-5p釋放到血清中，呈現隨疾病進展逐漸上升的趨勢。有學者在對HBV感染患者的疾病進展研究中發現，隨著肝硬化程度惡化，細胞內的miR-125b-5p水平顯著下降，外周血中的miR-125b-5p呈上升趨勢[12]，與本研究結果一致。同時也有研究指出，miR-125b-5p還可抑制機體的wnt信號通路，進一步降低局部病灶部位的炎癥反應以及氧化應激反應，在一定程度上降低HBV疾病的進展[8,13-14]。在對患者的肝功能以及免疫功能的分析中，患者的miR-125b-5p、miR-122-3p與機體的肝功能以及免疫功能相關，驗證了miR-125b-5p、miR-122-3p對于機體的炎癥反應以及氧化應激反應的預測。

此外，本文分析了患者的miR-125b-5p、miR-122-3p兩指標聯合檢測的效能，發現聯合檢測的特異度優于單獨檢測，兩指標聯合檢測ROC曲線下面積顯著高于單獨檢測，且獲得miR-125b-5p、miR-122-3p最佳臨界值，可在一定程度上對治療效果進行分析，及早對治療效果進行預測。

綜上所述，miR-125b-5p、miR-122-3p的表達水平與HBV患者肝功能、免疫功能顯著相關，miR-125b-5p、miR-122-3p對HBV的治療效果具有預測價值。但是本研究還存在一定的局限性，由于納入的樣本量較小，還需在后期臨床研究中進行驗證。