超氧化物歧化酶融合蛋白改善阿爾茨海默病小鼠大腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)實驗研究

程 艷，郭建偉，李 揚(yáng)，薛榮亮

(1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安 710068；2.西安國際醫(yī)學(xué)中心醫(yī)院麻醉與舒適化醫(yī)療中心，陜西 西安 710100)

體視學(xué)方法通過觀察和測量二維切片信息而獲得精確三維定量的顯微結(jié)構(gòu)信息。簡單來講，當(dāng)三維空間內(nèi)的立體結(jié)構(gòu)表現(xiàn)在二維切面上時，三維空間體積特征即表現(xiàn)為二維切面上的面積特征，三維空間內(nèi)表面積在二維切面上表現(xiàn)為邊界線(輪廓)，線性結(jié)構(gòu)無論其在三維空間內(nèi)怎樣走行，在二維切面上僅僅表現(xiàn)為斷面數(shù)(點(diǎn))。體視學(xué)的三維定量研究被國際上公認(rèn)為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最準(zhǔn)確、最精確的三維定量研究方法，許多領(lǐng)域如神經(jīng)科學(xué)、影像學(xué)、病理學(xué)等廣泛應(yīng)用此種方法進(jìn)行有關(guān)三維定量的相關(guān)研究[1]。然而對于神經(jīng)纖維的形態(tài)學(xué)研究較少，尤其是基于方法學(xué)設(shè)計的體視學(xué)研究在神經(jīng)領(lǐng)域應(yīng)用較少。幾個基于設(shè)計的體視學(xué)研究發(fā)現(xiàn)阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)海馬組織顯示(不同于正常老化)大量神經(jīng)元丟失在CA1區(qū)[2-5]，這種選擇性的神經(jīng)元喪失是在臨床前期，即AD患者出現(xiàn)斑塊形成之前發(fā)生的，在此期間大腦中有大量淀粉樣蛋白沉積，但沒有認(rèn)知能力下降的證據(jù)[5]。因此，體視學(xué)研究在AD中占據(jù)著重要位置，其可通過定量測量揭示AD病因或疾病發(fā)展過程，為AD治療提供可能的機(jī)會。

有研究[6-8]表明，氧化應(yīng)激產(chǎn)生的大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)及其氧化損傷在許多與神經(jīng)變性相關(guān)疾病(如AD)的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。線粒體也在神經(jīng)元功能中起關(guān)鍵作用，并且這些功能的幾乎所有方面都在AD中發(fā)生改變[9]。氧化應(yīng)激被認(rèn)為是包括AD在內(nèi)的廣泛神經(jīng)系統(tǒng)疾病中神經(jīng)元損傷的主要原因[10-11]，超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是針對ROS的主要抗氧化劑防御系統(tǒng)[12]，分子量大且沒有特異性受體，這使得它難以穿過血腦屏障及細(xì)胞膜進(jìn)入腦內(nèi)發(fā)揮作用。本課題組前期構(gòu)建了pET16b-PTD4-Cu、Zn-SOD重組表達(dá)載體并進(jìn)行優(yōu)化，其表達(dá)蛋白(SOD融合蛋白)表現(xiàn)出特定的跨膜能力，可以進(jìn)入體外培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細(xì)胞[13-16]。因此，本研究擬通過現(xiàn)代體視學(xué)方法探究SOD融合蛋白對AD小鼠腦白質(zhì)(White matter，WM)及其超微結(jié)構(gòu)的影響，以為AD抗氧化治療提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選用32只健康清潔、體重30～35 g的昆明雄性小鼠(購自西安交通大學(xué)動物實驗中心)，飼養(yǎng)于恒定溫度(23±1)℃、恒定濕度(60±10)%和12 h明暗周期的無病原體環(huán)境中，飲用水和食物不受限制。本實驗根據(jù)《實驗動物的護(hù)理和使用指南》進(jìn)行動物飼養(yǎng)和處理，并通過西安交通大學(xué)動物實驗倫理審查。

1.2 主要試劑 β-淀粉樣蛋白(Aβ)1-42蛋白寡聚體(107761-42-2，上海吉爾生化有限公司)；PBS干粉(PW013，西安赫特生物科技有限公司)；多聚甲醛(PI014，西安赫特生物科技有限公司)；瓊脂粉(Q-0024796，法國Biowest生物有限公司)；青霉素(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥劑科)；苦味酸(汕頭西隴化工公司)；10%水合氯醛、25%戊二醛水溶液及0.9%氯化鈉溶液(實驗室配制)；75%乙醇消毒液及雙蒸水(實驗室提供)。

1.3 小鼠分組及實驗流程 32只昆明雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)、SOD干預(yù)模型組(SM組)和SOD融合蛋白干預(yù)模型組(PM組)，每組8只。在實驗第9～23天，通過小鼠連續(xù)腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液(S組和M組)、6 mg/(kg·d) SOD(SM組)或6 mg/(kg·d) SOD融合蛋白(PM組)進(jìn)行預(yù)防干預(yù)。其中，在實驗第16天，通過5 μl微量注射器將0.9%氯化鈉溶液(S組，2 μl/只)及Aβ1-42寡聚體(M組、SM組及PM組，2 μl/只)注射于小鼠右側(cè)腦室，以制備AD模型。在第32天，隨機(jī)選取一側(cè)大腦半球用ELISA法測定腦組織勻漿中的SOD活力和丙二醛(MDA)水平，另一側(cè)大腦半球固定于2%甲醛+2.5%戊二醛溶液中，應(yīng)用現(xiàn)代體視學(xué)方法定量分析小鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)變化。

1.3.1 立體定位腦室內(nèi)Aβ1-42輸注：4%水合氯醛(300～350 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，將其背位固定于腦立體定位儀(SR-5，Narishige)上。參考George Paxinos等編著的《小鼠腦立體定位圖譜》，選定并標(biāo)記小鼠右側(cè)腦室的進(jìn)針點(diǎn)，即由前囟向后0.45 mm、矢狀縫向右側(cè)1.0 mm的位置，在標(biāo)記的進(jìn)針點(diǎn)處進(jìn)行顱骨鉆孔，將5 μl微量注射器自硬膜下垂直進(jìn)針2.0 mm，緩慢注射2 μg Aβ1-42寡聚體于側(cè)腦室中。注射完畢后，留針20 min后緩慢拔出微量注射器，縫合頭頂皮膚。再次消毒手術(shù)區(qū)域后，每只小鼠肌注青霉素約2萬單位，歸籠，嚴(yán)密監(jiān)測小鼠呼吸是否正常。

1.3.2 標(biāo)本取材：仰臥位固定并麻醉小鼠，夾起胸部靠近劍突下的皮膚，剪開胸腔皮膚和肋骨，并剪開膈肌，充分暴露小鼠心臟與肝臟。夾起室間隔靠近右心室處，將輸液器鋼制針頭插入小鼠左心室并用動脈夾妥善固定，然后剪開右心耳流出血液，打開輸液器控制閥灌注0.9%氯化鈉溶液，10 min左右血液完全排出后可觀察到小鼠肝臟及四肢發(fā)白，此時即表示灌注良好。將小鼠頭部皮膚剪開，露出顱骨，剝開頭蓋骨，輕柔剪開腦實質(zhì)表面軟腦膜，減掉周圍的顱神經(jīng)及結(jié)締組織，進(jìn)而剝離出整個腦。將剝離出的腦沿大腦縱裂切開，分成左、右半球，隨機(jī)取一側(cè)大腦半球迅速進(jìn)行液氮冷凍保存，后儲存在-80 ℃冰箱中，以進(jìn)行后期的SOD活力和MDA水平檢測，另一側(cè)大腦半球置入之前配制好的混合固定液(2%多聚甲醛+2.5%戊二醛)中進(jìn)行標(biāo)本固定。

1.3.3 大腦組織勻漿SOD活力和MDA水平檢測：將新鮮大腦半球組織以1∶10(m/V)加入RIPA裂解液，用機(jī)械研磨與超聲破碎儀打碎組織，制備10%的組織勻漿，高速離心后取上清液，檢測SOD活力和MDA水平。

1.3.4 大腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)體視學(xué)研究

1.3.4.1 計算AD小鼠大腦半球白質(zhì)總體積：隨機(jī)選擇沿冠狀面的子代鼠腦切片數(shù)個，將等距點(diǎn)陣圖與切片隨機(jī)疊加，在解剖顯微鏡下計數(shù)所有與白質(zhì)重疊的點(diǎn)∑PWM，計算白質(zhì)總體積VWM。VWM=t×a(p)×∑PWM，其中t為連續(xù)切片厚度，a(p)為與每個網(wǎng)格點(diǎn)相關(guān)的面積。

1.3.4.2 獲取電鏡照片：從選定腦切片上獲得包含腦白質(zhì)的組織塊，進(jìn)行電鏡包埋，使用透射電鏡觀察電鏡切片，每張切片上系統(tǒng)抽取5個8000倍及10個15000倍的視野。

1.3.4.3 計算白質(zhì)中有髓纖維的長度密度和總長度：將無偏計數(shù)框與8000倍電鏡照片隨機(jī)疊加，計算白質(zhì)中有髓纖維的長度密度LV(mf/wm) 和總長度L(mf，wm)。LV(mf/wm)=2×∑Q(mf)/[a(frame)×∑frame]，L(mf，wm)=LV(mf/wm)×VWM，其中∑Q(mf)是通過無偏計數(shù)框計數(shù)得出的電鏡照片中有髓纖維的總個數(shù)，a(frame)為單個無偏計數(shù)框的面積，∑frame為計數(shù)框的總個數(shù)。

1.3.4.4 計算白質(zhì)中有髓纖維及髓鞘的體積密度和總體積：將等距點(diǎn)陣圖與8000倍電鏡照片隨機(jī)疊加，計數(shù)所有落在白質(zhì)點(diǎn)數(shù)∑P(wm)、落在有髓纖維點(diǎn)數(shù)∑P(mf)及落在髓鞘點(diǎn)數(shù)∑P(ms)，計算有髓纖維的體積密度VV(mf/wm)、髓鞘的體積密度VV(ms/wm)、有髓纖維的總體積V(mf，wm)及髓鞘的總體積V(ms，wm)。Vv(mf/wm)=∑P(mf)/∑P(wm)，Vv(ms/wm)=∑P(ms)/∑P(wm)，V(mf，wm)=Vv(mf/wm)×VWM，V(ms，wm)=Vv(ms/wm)×VWM。

1.3.4.5 計算有髓纖維內(nèi)直徑與外直徑：將無偏計數(shù)框與15000倍電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無偏計數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面。通過測量垂直于有髓纖維最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的外直徑，通過測量垂直于軸突最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的內(nèi)直徑，測量內(nèi)、外直徑，計算內(nèi)、外直徑比值和差值。

1.3.4.6 計算有髓纖維內(nèi)周長及外周長：將無偏計數(shù)框及等距平行線與15000倍電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無偏計數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面，計算斷面內(nèi)有髓纖維的內(nèi)周長或外周長b(ms)。b(ms)=π/2×d×∑I，其中d為等距平行線間的垂直距離，∑I為等距平行線與落在無偏計數(shù)框內(nèi)的髓鞘內(nèi)緣界線或外緣界線交叉的總點(diǎn)數(shù)，進(jìn)而計算內(nèi)、外周長比值和差值。

2 結(jié) 果

2.1 四組小鼠不同時間點(diǎn)體重比較 見表1。選取實驗第8、24、31天小鼠體重進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果顯示四組小鼠體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 四組小鼠不同時間點(diǎn)體重比較(g)

2.2 四組小鼠SOD活力與MDA水平比較 見表2。M組SOD活力低于S組，PM組SOD活力高于M組(均P<0.05)。M組MDA水平高于S組，PM組MDA水平低于M組(均P<0.05)。

表2 四組小鼠SOD活力與MDA水平比較

2.3 四組小鼠大腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積比較 見圖1。M組小鼠腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積低于S組，PM組小鼠腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積高于M組(均P<0.05)。

圖1 四組小鼠腦白質(zhì)總體積(A)、有髓神經(jīng)纖維總長度(B)、有髓神經(jīng)纖維總體積(C)、髓鞘總體積(D)比較注：與M組比較，*P<0.05

2.4 四組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘體視學(xué)分析 見表3。M組小鼠髓鞘內(nèi)直徑及外直徑低于S組，PM組小鼠髓鞘內(nèi)直徑及外直徑高于M組(均P<0.05)。

表3 四組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘體視學(xué)分析結(jié)果

2.5 腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與腦組織勻漿中SOD活力及MDA水平相關(guān)性分析 一側(cè)腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與腦組織勻漿中SOD活力呈正相關(guān)，而與MDA水平呈負(fù)相關(guān)(r=0.522、0.522、0.501、0.466、-0.608、-0.613、-0.482、-0.661，均P<0.05)。

3 討 論

WM占人類總腦容量約50%，對于跨越不同腦區(qū)的電信號傳輸至關(guān)重要，因此WM損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)行為和認(rèn)知障礙[17]。Nasrabady等[18]使用磁共振成像研究表明，WM高信號可預(yù)測AD發(fā)病率及AD患者認(rèn)知能力下降的速度，并與AD遺傳危險因素相關(guān)。WM主要由成束的髓鞘或無髓鞘的軸突和產(chǎn)生髓磷脂的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成[19]，WM中的髓鞘軸突是皮質(zhì)和皮質(zhì)下區(qū)域之間有效神經(jīng)傳遞的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[17]，WM損傷在組織病理學(xué)上與髓磷脂蒼白、髓磷脂丟失和髓鞘軸突丟失有關(guān)[20]。本研究發(fā)現(xiàn)AD模型小鼠腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維和髓鞘的總體積以及有髓神經(jīng)纖維總長度均顯著減少，與既往研究[17]一致，說明白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)損害可能是AD患者學(xué)習(xí)和記憶能力受損的病理基礎(chǔ)。

在AD的背景下生物分子的氧化主要與神經(jīng)元膜生物分子和膜完整性的破壞有關(guān)，涉及脂質(zhì)(包括膽固醇)、蛋白質(zhì)和核酸的氧化，以及由于其氧化導(dǎo)致的低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)對β-淀粉樣蛋白清除的損害[21]。腦WM的特征在于髓鞘的存在，而髓鞘由約70%脂質(zhì)和約30%蛋白質(zhì)組成[17]。傳統(tǒng)模型表明，白質(zhì)中固有的抗氧化性能可能相對較低[22-23]，而富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的髓鞘可以為過氧化反應(yīng)提供豐富的底物而導(dǎo)致大量ROS的產(chǎn)生。本研究對髓鞘的分析發(fā)現(xiàn)，其內(nèi)直徑及外直徑明顯降低，其殘存量與抗氧化能力呈正相關(guān)，而與過氧化水平呈負(fù)相關(guān)，因此推測AD小鼠中髓鞘脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的過氧化會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)或功能改變，影響WM在腦區(qū)信號傳遞中的作用，進(jìn)而導(dǎo)致認(rèn)知和行為障礙，而SOD融合蛋白可通過降低髓鞘脂質(zhì)和蛋白質(zhì)過氧化水平來保護(hù)WM功能免受損害，從而改善AD小鼠認(rèn)知和記憶能力。有髓神經(jīng)纖維髓鞘主要由少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，有研究[24-25]發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)少突膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞死亡，或抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的分化，即其破壞少突膠質(zhì)細(xì)胞的成熟，因此氧化應(yīng)激可能通過破壞髓鞘結(jié)構(gòu)影響WM的傳導(dǎo)功能，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)和記憶功能障礙。而SOD融合蛋白可通過減輕氧化應(yīng)激維持少突膠質(zhì)細(xì)胞功能，從而維持髓鞘完整，減少學(xué)習(xí)和記憶能力損傷。

研究[11]發(fā)現(xiàn)，AD等病理狀態(tài)下產(chǎn)生的大量ROS可以快速活化小膠質(zhì)細(xì)胞，而處于活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞可以產(chǎn)生多種神經(jīng)毒性因子參與與神經(jīng)退行性變相關(guān)的炎癥反應(yīng)過程。產(chǎn)生的神經(jīng)毒性因子包括促炎細(xì)胞因子和趨化因子等，它們通過激活RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn) 環(huán)氧化酶(COX)-2表達(dá)和血小板活化。COX-2可以通過形成不同類型的自由基來增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，引起磷脂過氧化。血小板活化可通過增加谷氨酸鹽的釋放以及耦合突觸后N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體活化，增加一氧化氮的產(chǎn)生和隨后的線粒體去極化。這些事件共同促進(jìn)了ROS的下游產(chǎn)生，導(dǎo)致WM損傷并進(jìn)一步加重了認(rèn)知功能障礙。另一方面，小膠質(zhì)細(xì)胞參與神經(jīng)發(fā)生，其炎性激活或產(chǎn)生神經(jīng)毒性因子和細(xì)胞因子而破壞神經(jīng)發(fā)生過程。活化小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性炎癥潛能可能延伸至少突膠質(zhì)細(xì)胞，從而導(dǎo)致WM微觀結(jié)構(gòu)改變，最終引起行為學(xué)改變。例如，腫瘤壞死因子(TNF)-α是一種主要的促炎細(xì)胞因子，通過少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞表達(dá)的TNF受體發(fā)揮作用，并能抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的存活和分化，而干擾素(IFN)-γ則通過促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞的代謝紊亂甚至細(xì)胞死亡來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂產(chǎn)生有害作用，隨后降低髓磷脂蛋白基因的表達(dá)，從而降低少突膠質(zhì)細(xì)胞的髓鞘或髓鞘再生潛能。這些事件通過損傷少突膠質(zhì)細(xì)胞而導(dǎo)致WM微觀結(jié)構(gòu)受損，并導(dǎo)致AD小鼠行為障礙。這與本研究中AD小鼠WM損傷的結(jié)果一致，而抗氧化劑SOD融合蛋白可以通過清除ROS逆轉(zhuǎn)上述過程。

綜上所述，SOD融合蛋白腹腔干預(yù)可以減輕Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平以及腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)變化。AD小鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激可能是白質(zhì)受損的病理基礎(chǔ)。