支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒糖皮質(zhì)激素受體α、β mRNA表達檢測及其與血清炎癥因子、肺功能相關(guān)性分析

謝 勇，郭麗麗

(1.榆林市星元醫(yī)院兒科，陜西 榆林 719000；2.榆林市第一醫(yī)院兒科，陜西 榆林 719000)

支氣管哮喘的主要特征是患者氣道出現(xiàn)慢性炎癥反應(yīng)，好發(fā)于兒童，是威脅兒童健康的常見疾病之一，臨床癥狀表現(xiàn)為氣急、咳嗽、胸悶等，均易反復(fù)發(fā)作[1]。目前該病的發(fā)生機制還不明確，不過近年來有關(guān)病原體感染與支氣管哮喘發(fā)病關(guān)系的研究得到廣泛重視。肺炎支原體是一種原核細胞型、無細胞壁的微生物，不需要細胞培養(yǎng)基，通過呼吸道飛沫和直接接觸傳播，能獨自胞外生長[2-3]。現(xiàn)代研究[4-5]表明，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染發(fā)病的關(guān)鍵機制是Th1/Th2平衡失調(diào)，因此該疾病屬于一種免疫失衡性疾病。糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GC)是由腎上腺皮質(zhì)束狀帶分泌的類同醇類內(nèi)分泌激素，能介導(dǎo)T淋巴細胞的激活和淋巴因子的產(chǎn)生，從而產(chǎn)生抑制炎癥反應(yīng)、快速控制支氣管哮喘癥狀的作用[6-7]。GC在體內(nèi)主要與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)特異性結(jié)合才能發(fā)揮作用，后者屬于核受體超家族的一個亞家族[8]。GR在有核細胞中廣泛表達，從而在機體代謝、分化及發(fā)育中發(fā)揮重要作用[9-10]。GR主要有2個亞型，即GR-α和GR-β。本研究主要探討支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒GR-α和GR-β mRNA的表達情況，并分析其與血清炎癥因子、肺功能的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2019年2月到2021年4月我院接診的支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒、單純支氣管哮喘患兒及同期體檢健康的兒童各54例，分別納入合并組、單純哮喘組和對照組。三組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：合并組患兒均符合支氣管哮喘合并肺炎支原體感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)；單純哮喘組患兒均符合支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡1～8歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他系統(tǒng)性疾??；有過敏性疾病史；免疫功能低下；低出生體重；先天性氣道畸形。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)實施。患兒家屬均對本研究知情同意并簽署知情同意書。

表1 三組一般資料比較

1.2 研究方法

1.2.1 GR-α、GR-β mRNA表達檢測：采集所有兒童的咽拭子樣本，按核酸同步抽提試劑盒(批號：48814221，Qiagen公司)要求提取核酸，測定純度及濃度。檢索NCBI Gene Bank數(shù)據(jù)庫，應(yīng)用Bio-Edit軟件設(shè)計GR-α、GR-β引物(GR-α正向序列為5’-CCCAGTGAATCCAGACAAGT-3’，反向序列為5’-GTGTATCCAATCACCTATGAG-3’；GR-β正向序列為5’-CCAAGCTGATCCCAAAGGGAC-3’，反向序列為5’-CCATCGGGCATCCAATITCC-3’)。由大連TAKARA公司進行引物合成，采用qPCR方法檢測GR-α、GR-β mRNA相對表達水平，以β-actin作為擴增內(nèi)對照組。

1.2.2 血清炎癥因子含量檢測：抽取三組兒童空腹靜脈血2～3 ml，采用EDTA抗凝后在4 ℃條件下以3000 r/min離心10 min，取上清后保存于-80 ℃冰箱。腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-13(IL-13)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)等炎癥因子含量使用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進行檢測(試劑盒批號：28848001、37714222、61975244、89138842，上海生工公司)。

1.2.3 臨床資料調(diào)查：采用自行設(shè)計的統(tǒng)一問卷調(diào)查表，對所有患兒的性別、年齡、體重、身高、吸氣時間、呼氣時間、第一秒用力呼氣容積(FEV1)、FEV1/用力肺活量(FVC)等指標(biāo)。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較三組GR-α、GR-β mRNA表達水平；②比較三組血清炎癥因子(TNF-α、IL-6、IL-13、CRP)表達水平；③比較三組肺功能指標(biāo)[吸氣時間、呼氣時間、第一秒用力呼氣容積(FEV1)及FEV1/FVC]水平；④分析GR-α、GR-β mRNA表達與炎癥因子、肺功能的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1 三組GR-α、GR-β mRNA相對表達水平比較 見表2。合并組與單純哮喘組GR-α、GR-β mRNA相對表達水平高于對照組，且合并組高于單純哮喘組(均P<0.05)。

表2 三組GR-α、GR-β mRNA相對表達水平比較

2.2 三組血清炎癥因子含量比較 見表3。合并組與單純哮喘組血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于對照組，且合并組高于單純哮喘組(均P<0.05)。三組血清CRP含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表3 三組血清炎癥因子含量比較

2.3 三組肺功能比較 見表4。合并組與單純哮喘組吸氣時間低于對照組，且合并組低于單純哮喘組(均P<0.05)。三組呼氣時間、FEV1、FEV1/FVC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

表4 三組肺功能比較

2.4 合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達水平與炎癥因子、肺功能相關(guān)性分析 見表5。Pearson相關(guān)性分析顯示，合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達水平與血清TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相關(guān)，與吸氣時間呈負相關(guān)(均P<0.05)。

表5 合并組患兒GR-α、GR-β mRNA相對表達水平與炎癥因子、肺功能的相關(guān)性

3 討 論

支氣管哮喘是以T淋巴細胞、肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤為主，伴有巨噬細胞和淋巴細胞等參與調(diào)節(jié)的氣道慢性、反復(fù)發(fā)作性疾病[11-12]。肺炎支原體為一種非典型病原體，也是患兒呼吸道感染的重要病原體，為導(dǎo)致支氣管哮喘發(fā)作的一個重要因素[13]。GR-α、GR-β屬于核受體超家族的重要成員，都為典型的激素依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要存在于有核細胞中。GR-α、GR-β為GR基因同一轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)不同剪切方式而產(chǎn)生，其中GR-α在多數(shù)細胞中的含量超過GR-β，且GC主要通過結(jié)合GR-α發(fā)揮作用[14]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組的GR-α、GR-β mRNA相對表達水平高于對照組，且合并組高于單純哮喘組。從機制上分析，GR-α、GR-β表達增加可使得其與GC的親和力顯著下調(diào)，有利于增加局部淋巴細胞增殖、活化及細胞因子的產(chǎn)生和釋放，導(dǎo)致機體產(chǎn)生免疫損傷，從而使患兒處于免疫紊亂狀態(tài)，導(dǎo)致病情惡化[15-16]。

支氣管哮喘的三大特征是氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性及氣流受限，其中支氣管哮喘的病理基礎(chǔ)是氣道炎癥，因為炎癥因子過量釋放會導(dǎo)致支氣管哮喘的發(fā)生與發(fā)展[17]。IL-6、IL-13由機體內(nèi)的淋巴和非淋巴組織細胞產(chǎn)生，可參加炎癥介質(zhì)的級聯(lián)反應(yīng)。TNF-α可促進形成逐級放大的瀑布樣連鎖反應(yīng)，誘導(dǎo)組織細胞損害，因此被認為是引起支氣管哮喘的重要細胞因子之一[18]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組的血清TNF-α、IL-6、IL-13含量高于對照組，且合并組高于單純哮喘組。從機制上分析，肺炎支原體感染可通過其特殊結(jié)構(gòu)緊密黏附于一些宿主細胞膜的受體上，導(dǎo)致機體清除病原體的能力減弱，同時釋放有害的代謝產(chǎn)物，使宿主細胞受損；并且肺炎支原體感染可影響免疫細胞分泌細胞因子而參與支氣管哮喘的發(fā)病[19]。

通過肺功能動態(tài)觀察能夠較準(zhǔn)確地評估支氣管哮喘患兒的氣道受損程度，從而減少支氣管哮喘對患兒的危害程度，同時還可以減少支氣管哮喘的發(fā)病率[20]。本研究顯示，合并組與單純哮喘組吸氣時間低于對照組，且合并組低于單純哮喘組；三組呼氣時間、FEV1、FEV1/FVC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。究其原因，肺炎支原體感染可導(dǎo)致機體出現(xiàn)支氣管上皮受損，進而出現(xiàn)小氣管收縮，從而降低患兒的吸氣時間。Pearson相關(guān)性分析顯示，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒的GR-α、GR-β mRNA相對表達水平與TNF-α、IL-6、IL-13含量呈正相關(guān)，與吸氣時間呈負相關(guān)。從機制上分析，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染是一種患兒常見的呼吸系統(tǒng)疾病，也是一種由多種免疫細胞參與的慢性氣道變應(yīng)性炎癥性疾病。GC可以通過與GR結(jié)合產(chǎn)生抗炎作用。當(dāng)機體突然停用高效GC制劑后，GR與GC的親和力下降，致使內(nèi)源性GC不能很好地發(fā)揮其生物效應(yīng)，引起細胞因子、炎癥介質(zhì)釋放增加，導(dǎo)致機體容易受到感染侵襲。

綜上所述，支氣管哮喘合并肺炎支原體感染患兒多呈現(xiàn)GR-α、GR-β mRNA的高表達，而GR-α、GR-β mRNA相對表達水平與患兒血清炎癥因子、肺功能密切相關(guān)。但本研究也有一定的不足，病例人數(shù)比較少，且指標(biāo)相對單一，下一步將增加樣本量和相關(guān)指標(biāo)進行更深入的分析。