一種新型生物反應器的基因測序分析

杜 巍 王 坤 蘆旭飛 葉天彤

（北京京環新能環境科技有限公司，北京 100020）

0 引言

垃圾填埋滲瀝液通常指填埋過程中及雨水滲漏產生的液體。基因測序是指通過對微生物的遺傳基因進行測定來確定環境中微生物的種類和濃度的一種分子生物學分析方法。16S核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）測序是一種特殊的基因測序方式，其中16S指的是細菌RNA的沉降系數，即顆粒在單位離心力場中粒子的移動速度，對大分子物質沉降系數通常在10 s~13 s左右。對細菌的基因組織進行離心沉降后，按照沉降系數可分為3種，即5S、16S和23S。細菌的16S RNA高變區具有明顯的細菌種屬特征，便于區分不同細菌。因此對細菌16S RNA高變區的擴增產物進行高通量測序，再將所得結果與數據庫比較，可以得到樣品中細菌的菌群結構和多樣性及分布特征。

胡小松等對復齒鼯鼠干燥糞便樣品中微生物16S RNA基因進行測序，發現厚壁菌門（87.68%±2.68%）、擬桿菌門（7.62%±3.74%）為優勢菌門。李俊峰基于16S RNA分析流程找出了在胃炎病人和健康人中豐度顯著差異的物種。郝兵兵從膜生物反應器（membrane bio-reactor，MBR）反應器中分離純化、篩選出一株假單胞菌，該菌株對水產養殖廢水中的硝酸鹽有較好去除效果。

1 材料與方法

1.1 測試方法與流程說明

1.2 樣品分組與多樣性分析方法

該研究將對接種菌種樣品、實際生物反應器樣品、曝氣池樣品3類樣品進行16S RNA基因測序，得到樣品信息庫，最終根據結果進行多樣性分析。

對所測樣品根據其來源分為A、B、C共3組，其中A組為接種菌種樣品組，B組為實際生物反應器樣品組，C組為曝氣池樣品組。菌種原樣標記為ACJ1；生物反應器段標記為BZP1、BZP2；曝氣池段標記為CBQ1、CBQ2、CBQ3和CBQ4，具體的取樣分組信息見表1。

表1 16S RNA測序分組情況表

這里采取組間進行A組與B組BZP1、A組與C組CBQ2、A組與C組CBQ4共3次對比。這一過程將依次采取趙式（the chao1 index，Chao1）菌群豐富度指數曲線、香農-威納（shannon-wiener，Shannon）多樣性指數曲線、辛普森（ginisimpson，simpson）多樣性指數曲線以及準確覆蓋率（Good′s

該研究是針對北京某填埋場的生物反應器滲瀝液處理設施而進行的。該處理設施采用生物反應器+曝氣池+膜處理工藝對填埋場滲瀝液進行處理，其中生物反應器+曝氣池為前端生化處理部分，具體流程圖詳如圖1所示。該研究旨在通過16S RNA基因測序研究能夠適應垃圾滲瀝液這種高鹽高氨氮環境的微生物的種群分布及主要功能菌。coverage）測序深度曲線對OTU數據測定結果進行全面和準確性檢驗，確保后續利用OTU數據得到正確的分析結論。

圖1 生物反應器-膜處理工藝流程示意圖

chao1指數稀釋曲線指的是用chao1算法估計群落中含OTU數目的指數，是一種生態學中常用的估計物種總數的方法，如公式（1）所示。

式中：1是估計的OTU數；是實際觀察的OTU數；是只有1條序列的OTU數目；是只有2條序列的OTU數目。

shannon-wiener指數稀釋曲線，反映樣品中微生物多樣性的指數，利用各樣品的測序量在不同測序深度時的微生物多樣性指數構建曲線，以此反映各樣本在不同測序數量時的微生物多樣性。

計算指數如公式（2）所示。

式中：為-指數。各種之間，個體分配越均勻，值就越大；為個體序號。為樣品中屬于第種的個體的比例，如樣品總個體數為，第種個體數為，則=/。

Simpson指數稀釋曲線在生態學中常常用來定量描述一個區域的生物多樣性。當樣品中只有1個物種時（即所有序列都代表同一個物種），值為0；當樣品中各物種均勻分布時，值為1。Simpson指數值越大，越均勻，群落多樣性越高。Simpson指數計算公式如公式（3）所示。

式中：為Simpson指數；n為樣品中含條序列的OTU 數；為樣品總序列數。

Good′s coverage指數稀釋曲線用于評估測序結果代表的菌種群落中物種的總數，常用于評估測序深度是否足夠。其計算公式如公式（4）所示。

式中：為Good's coverage指數；為樣本中OTUs的數量；為OTUs總豐度。

2 組間對比分析

2.1 ACJ1與 BZP1對比分析

ACJ1與BZP1這2組數據的多樣性對比見表2。從表2中可以明顯看出，ACJ1與BZP1從多種測試方法角度來看均存在較大差異。實際操作過程中，ACJ1為培養初期所使用的菌種，BZP1為經過長時間馴化后實際生物反應器工藝段中存在的菌種。顯然，實際過程中菌種組成已發生了較大改變，因此后續將單獨探究BZP1為代表的生物反應器工藝段中的優勢菌，以探究滲瀝液處理中的脫氮優勢菌。

表2 ACJ1與BZP2測定結果對比表

2.2 ACJ1與 CBQ2對比分析

ACJ1與CBQ2兩組數據的多樣性對比見表3。從表3中可以明顯看出，ACJ1與CBQ2從多種測試方法角度來看均存在較大差異。實際操作過程中，ACJ1為培養初期所使用的菌種，CBQ2為經過長時間馴化后曝氣池工藝段中存在的菌種。顯然，實際過程中菌種組成已發生了較大改變，因此后續將單獨探究CBQ2為代表的曝氣池工藝段中的優勢菌，以探究滲瀝液處理中的脫氮優勢菌。

表3 ACJ1與CBQ2測定結果對比表

上述分析證明所得OTU數據準確性和多樣性滿足后續分析要求，因此進入下一步分析階段。

3 豐度分析

3.1 接種原樣豐度圖

接種原樣分析圖見圖2及表4。

圖2 接種原樣菌種豐度分布圖

表4 接種原樣菌種占比表

從圖2及表4中可以看出，主要優勢門類為變形菌門和厚壁菌門，其中厚壁菌門主要為梭狀芽胞桿菌綱、桿菌綱。

這里對廠家接種樣品的思路做如下猜想。1） 先利用變形菌門內的各種細菌的不同適應性，在不良水質下迅速繁殖并有效提升污泥濃度，與此同時若生存環境仍過于惡劣，芽孢桿菌釋放芽孢，并進入休眠狀態，等待后續環境改善后重新恢復活力。2） 變形菌門內的各種細菌大量繁殖后逐步改善水質，進入生長穩定期，同時，芽孢桿菌開始恢復活力，進入繁殖階段并進一步改善水質。3） 主要菌種繁殖基本結束，進入穩定運行狀態，工藝出水逐漸穩定。

3.2 生物反應器樣品分析

生物反應器樣品豐度圖見圖3及表5。

從圖3及表5中可以看出，主要優勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細菌綱。變形菌門為接種樣品中中添加較多的部分，該部分的存在符合正常規律。接種樣品中本不屬于優勢菌種的似桿菌最終數量超越了厚壁菌成了第2類優勢菌種，這說明安定填埋場的水質和處理環境較為適宜似桿菌門的生長，而厚壁菌門的細菌相對不適應上述環境，因此推斷安定衛生填埋場生物反應器工藝實際對TN去除占主導作用的桿狀細菌主要為似桿菌門類的各類細菌，如后續需要加強處理效果，可考慮適當投加對應菌種。

表5 生物反應器菌種占比表

圖3 生物反應器菌種豐度分布圖

3.3 曝氣池樣品分析

曝氣池樣品豐度圖見表6。

表6 （a）曝氣池1-1菌種占比表

表6 （b）曝氣池1-2菌種占比表

表6 （c）曝氣池1-3菌種占比表

從表6可以看出，主要優勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細菌綱。變形菌門為接種樣品中中添加較多的部分，該部分的存在符合正常規律。與轉盤情況類似，接種樣品中本不屬于優勢菌種的似桿菌最終數量超越了厚壁菌成了第2類優勢菌種，進一步證實了安定填埋場的水質和處理環境更適宜似桿菌門的生長。同時雖然圖中沒有顯示，但在表6（a）和表6（d）的結果中都存在含量為0.5%以下的產甲烷菌，證明控制溶解氧后即使不接種也能夠產生相關厭氧細菌，只是濃度受限。同時參考處理效果可以看出，曝氣池和生物反應器菌種類別和含量基本相近，只是因為曝氣量和整體結構不同而導致處理效果有所差異。

表6 （d）曝氣池1-4菌種占比表

4 結論

接種原樣中主要優勢門類為變形菌門和厚壁菌門，其中厚壁菌門主要為梭狀芽胞桿菌綱、桿菌綱；生物反應器樣品中主要優勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細菌綱；曝氣池樣品中主要優勢門類為變形菌門和似桿菌門，其中似桿菌門主要為黃桿菌綱、似桿菌綱和嗜鹽細菌綱。曝氣池和生物反應器菌種類別和含量基本相近，只是因為曝氣量和整體結構不同而導致處理效果有所差異；在曝氣量充足的情況下，似桿菌將逐漸取代厚壁菌成為生物除氮作用的優勢菌種。