比較兩種血紅蛋白A2測定方法對輕型α地中海貧血的診斷性能

王展強 楊華文 黃基偉 李亞紅 曹東林 雷達

廣東省第二人民醫院檢驗醫學部（廣州 510317）

α 地中海貧血（α 地貧）是由于α 珠蛋白基因缺陷導致的遺傳性溶血性貧血［1］。隨著α 珠蛋白基因缺陷數量的增加，相應臨床癥狀逐漸加重［2-3］，其中中間型和重型地貧患者只能依賴輸血維持生命［4-5］。血紅蛋白A2（hemoglobin A2，HbA2）是產前診斷中α 地貧篩查的重要指標之一［6-8］，結合血常規可初步判斷患者是否攜帶地貧基因［9］，并能節約社會醫療資源［10］。近年來高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛細管區帶電泳（capillary zone electrophoresis，CZE）廣泛應用于HbA2 的檢測［11-12］，多項研究比較了HPLC 和CZE 對HbA2 的檢測性能［13-15］，但尚無研究比較這兩種方法檢測HbA2 對α 地貧的診斷性能及其截斷值，本研究擬收集2019-2021年期間到本單位進行α 地貧篩查患者的臨床信息，比較CZE（法國賽比亞公司的Sebia 全自動電泳儀）和HPLC（美國伯樂公司的血紅蛋白分析系統）兩種方法測定的HbA2 對輕型α 地貧的診斷性能及截斷值，為產前診斷中α 地貧篩查提供診斷依據。

1 資料與方法

1.1 病例資料選取2019年1月至2021年12月在廣東省第二人民醫院進行α 地貧篩查的患者納入研究，收集患者臨床信息包括血常規、HbA2 和α 地貧基因結果等，根據α 地貧基因結果分為對照組和輕型α地貧組。

1.2 納入與排除標準輕型α 地貧組納入標準：（1）年齡在18～60 歲之間；（2）α 地貧基因結果為輕型。對照組納入標準：（1）年齡在18～60 歲之間；（2）α 地貧基因結果為陰性。排除標準：（1）攜帶β 地貧基因缺陷（突變/缺失）；（2）α 地貧基因結果為靜止型、中間型和重型；（3）合并有缺鐵性貧血或其他基礎性疾病如高血壓、糖尿病等。

1.3 研究方法

1.3.1 血常規檢測按照說明書使用Sysmex 全自動血球儀（型號：XN-3000，日本希思美康公司）及其配套試劑檢測全血樣本，獲取紅細胞的紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）和紅細胞平均血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）。

1.3.2 HbA2 的檢測按照說明書使用血紅蛋白分析系統（型號：VariantⅡ，美國伯樂公司）和Sebia全自動電泳儀（型號：APILLARYS OCTA3，法國賽比亞公司）及其相應配套試劑檢測全血樣本，獲取患者HbA2 的含量。

1.3.3 α地貧基因檢測按照說明書使用EZHighTMDNA Extraction Kit 提取全血樣本DNA；按照說明書使用α 地貧基因檢測試劑盒（中國亞能生物）對α 地貧基因進行分型測定，其中采用跨越斷裂點PCR 原理檢測α-地貧基因缺失位點（包括東南亞缺失型（--SEA/αα）、3.7缺失型（-α3.7/αα）、4.2缺失型（-α4.2/αα）），采用PCR-反向點雜交原理檢測α-地貧基因突變位點（包括Hb CS（CD142），TAA→CAA；Hb WS（CD122），CAC→CAG 和Hb QS（CD125），CTG→CCG）。

1.4 統計學方法使用SPSS 19.0 進行統計分析。參數資料采用均數加減標準差進行描述并使用獨立樣本t檢驗進行統計分析。采用ROC 曲線分析HbA2 對輕型α 地貧的診斷性能及截斷值。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 人群特征本研究共納入1 887 例受檢者，其中共有1 176 例受檢者使用HPLC 檢測HbA2（含218例輕型α地貧患者，占18.54%，表1）；另有711 例受檢者使用CZE 檢測HbA2（含169 例輕型α 地貧患者，占23.77%，表1）。在使用HPLC 檢測HbA2的218 例輕型α 地貧患者中，共有214 例診斷為東南亞缺失型，其他雙重雜合突變的輕型α 地貧有4 例；而使用CZE 檢測HbA2 的169 例輕型α 地貧患者中，共有165 例診斷為東南亞缺失型，其他雙重雜合突變有3 例。

收集上述受檢者的臨床信息并分析，結果顯示與對照組相比，輕型α 地貧組的MCV、MCH 和HbA2 在HPLC 和CZE 檢測的人群中均降低（表1），這提示輕型α 地貧患者呈小細胞低色素性貧血，同時α 地貧基因的缺陷也導致HbA2 含量下降。2.2 CZE 的特異度和靈敏度均優于HPLC根據α 地貧基因結果，計算不同HbA2 截斷值診斷輕型α 地貧的靈敏度和特異度，根據尤登指數選擇最佳的截斷值。結果顯示使用HPLC 檢測HbA2 時，當HbA2 為2.8%時，尤登指數最大，為0.383，對應的靈敏度和特異度分別為82.6%和55.7%（表2）；使用CZE 檢測HbA2 時，當HbA2 為2.6%時，尤登指數最大，為0.485，對應的靈敏度和特異度分別為91.1%和57.4%（表2），這提示當HbA2 分別取上述截斷值時，CZE 診斷輕型α 地貧的特異度和靈敏度均優于HPLC。

表1 人群特征Tab.1 Characteristics of the study population ±s

表1 人群特征Tab.1 Characteristics of the study population ±s

HPLC CZE對照組（n=958）輕型α 地貧組（n=218）t 值P 值對照組（n=542）輕型α 地貧組（n=169）t 值P 值年齡（歲）29.68±5.13 29.00±4.68 1.80 0.070 29.61±4.84 30.18±5.27-1.30 0.200 HbA2（%）2.78±0.39 2.57±0.21 10.85＜0.001 2.62±0.46 2.34±0.31 9.10＜0.001 MCV（fl）85.00±6.46 67.87±3.39 55.22＜0.001 85.89±7.53 68.99±3.79 38.78＜0.001 MCH（pg）29.03±2.81 21.58±1.22 60.53＜0.001 28.98±3.38 21.75±1.30 41.02＜0.001

表2 HbA2 在輕型α 地貧診斷中的截斷值Tab.2 The cut-off point of HbA2 in the diagnosis of α-thalassemia trait

2.3 CZE的診斷性能優于HPLC根據不同HbA2截斷值對應的特異度和靈敏度，分別繪制HPLC 和CZE 的ROC 曲線，結果顯示使用HPLC 檢測HbA2時，HbA2 診斷輕型α 地貧ROC 曲線AUC 為0.715（95%CI：0.682～0.747，P＜0.001，圖1A）；而使用CZE 檢測HbA2 時，AUC 為0.786（95%CI：0.751～0.821，P＜0.001，圖1B），這提示CZE 的診斷性能優于HPLC。

圖1 受試者工作曲線Fig.1 Receiver operating characteristic curve

3 討論

α 地貧好發于東南亞、地中海、南亞、中東和非洲等熱帶和亞熱帶地區［16-17］。在我國廣東、廣西地區α地貧攜帶率最高，分別為9.46%和14.13%［18］，此外，香港、臺灣、福建、江西、云南和貴州等地區的α 地貧發病情況也較為嚴峻［19］。在產前診斷中開展地貧篩查可降低地貧患兒的出生率，是阻止中間型和重型地貧患兒出生的有效措施，有利于提高人口質量［20-21］。本文通過收集2019-2021年期間本單位地貧篩查患者的臨床信息，首次通過回顧性研究比較了這兩種方法檢測HbA2 對輕型α 地貧的診斷性能和截斷值。本研究發現與對照組相比，輕型α 地貧患者的MCV、MCH 和HbA2 含量降低，HPLC 和CZE 兩種方法檢測HbA2 對輕型α 地貧均有較好的診斷性能，其截斷值分別為2.8%和2.6%，同時本研究首次發現使用CZE 檢測HbA2 時，對輕型α 地貧的診斷性能優于HPLC。

由于珠蛋白基因缺陷，珠蛋白合成障礙，α 地貧患者的紅細胞相關參數異常，本研究發現與對照組相比，輕型α 地貧組的MCV、MCH 和HbA2 均降低，這與前人的研究結果相一致［6，22-23］。然而有研究指出缺鐵性貧血患者的MCV、MCH 與地貧患者差異無統計學意義［24］，因此使用上述指標進行地貧篩查時應與缺鐵性貧血相鑒別。同時本研究發現使用HbA2 診斷輕型α 地貧時，CZE 的截斷值為2.6%，這與多項研究較為接近［6-7］；而HPLC 的截斷值為2.8%，遠遠低于前人的研究［25］，這可能是由于在該研究中沒有區分靜止型α 地貧和輕型α 地貧的緣故。此外，在本研究中CZE 的截斷值低于HPLC（2.6%vs.2.8%），這可能是由于其他血紅蛋白變異體對CZE 的影響小于HPLC 如HbE 等［26］，當使用HPLC 無法區分HbA2 與其他血紅蛋白變異體時，CZE 則能夠更好地區分，使得CZE 測得的HbA2 更接近真實值［15］。

本研究依然存在以下不足，首先，本研究納入的研究人群較大，無法同時使用兩種方法檢測同一患者的HbA2，無法比較兩種方法檢測結果的一致性；其次，本研究僅限于18～60 歲人群中輕型α地貧患者，未對其他年齡段和亞型進行研究分析；最后，本研究屬于回顧性研究，僅能收集到目前存在的數據，無法全面反映輕型α 地貧患者的狀態。因此，為了解決上述問題，還需要進行更深入的前瞻性臨床研究。此外，本研究發現CZE 的診斷性能優于HPLC，如何將CZE 測得的HbA2 與血常規結合以建立一套低成本、低漏診率和高特異度的地貧篩查流程并向臨床推廣應用還需要進一步研究。