利用分子機器的組裝與分解構建pH敏感性谷胱甘肽過氧化物人工酶

安紹杰，許洪峰，李思，許遠航，李佳錫

（沈陽化工大學材料科學與工程學院，遼寧 沈陽 110142）

引 言

谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)是一種非常重要的抗氧化酶，在維持生物體內活性氧(ROS)的平衡過程中起著無法替代的作用，對于預防和治療由于體內活性氧含量過高而導致的疾病（如各種炎癥、心腦血管疾病、白內障以及癌癥等）具有明顯的效果[1-4]。天然GPx 的催化中心是硒代半胱胺酸，由終止密碼子UGA 編碼，使其存在難以用基因工程方法進行量產的缺點。因此，為了使GPx在體內、體外的應用獲得更加廣泛的拓展，人工模擬GPx 的研究引起了科學家們極大的興趣[5-6]。

對GPx 的人工模擬最早始于Mugesh 等[7-8]合成的一系列小分子有機硒化合物和有機碲化合物。其中最成功的是依布硒啉（2-苯基苯并異硒唑-3-酮），作為一種優秀的抗氧化藥物，其在臨床試驗中受到了廣泛關注[9]。之后，多種經過化學修飾的含有GPx 催化中心的主體分子陸續開發出來，其中包括了環糊精分子[10]、抗體[11]以及天然酶[12]等。這些主體分子含有親水或者疏水的空腔結構，具有特異性識別不同底物的功能，使其人工GPx 模擬酶的催化效率獲得了極大提高。近二十年來，隨著超分子科學以及納米科學的快速發展，研究者們發明了膠束、囊泡以及納米管等多種人工酶的優良載體，并借此成功設計制備了多種超分子自組裝納米GPx人工酶[13-15]。這些納米人工酶所含有的疏水層與疏水底物之間具有疏水相互作用，使其具有一定的底物識別能力，從而展現出優良的催化活性。與此同時，更多的手段也被科學家們所利用，例如，通過基因工程改造制備特異性識別能力更精確的硒酶和碲酶，使得催化活性能夠媲美甚至超過天然GPx 的人工酶成為可能[16]。

由于天然酶活性的展現受到了生命體內不同環境的調控，隨著人工酶研究的不斷深入，科學家們的目光逐漸投向具有環境響應性的智能人工酶模型[17]。天然酶的活性在生命體內主要依靠非共價的弱相互作用來調控，因此包括主-客體、親-疏水、靜電、氫鍵、范德華力等非共價相互作用的超分子相互作用在構建智能人工酶領域具有得天獨厚的優勢[18]。在智能GPx 人工酶的研究中，Liu 等[19]做出了開創性的工作，他們利用一種經典的超分子相互作用——偶氮苯衍生物與含碲環糊精分子之間的主-客體相互作用設計了光敏性的智能GPx 人工酶。此后，Yin 等[20-21]將溫敏性聚合物聚（N-異丙基丙烯酰胺）作為基元，通過超分子自組裝手段設計了一系列含硒/碲活性中心的溫敏性微凝膠，從而構建了具有溫敏特性的智能GPx人工酶。

人體的胃液與體液之間以及癌細胞與正常細胞之間存在顯著的pH 差異，利用這種生命體內天然的pH 差異實現響應的智能人工酶，在藥物載體領域有著更廣泛的潛在應用[22-23]。近些年來，基于準輪烷分子且具有pH 響應的分子機器得到了迅速發展，它們能夠響應外界刺激信號產生可逆的往復運動從而實現開關效應，為構建pH 響應性智能GPx人工酶提供了全新的方法和思路[24-29]。其中，科學家們以葫蘆脲系列分子家族中的葫蘆[6]脲分子（CB[6]）為主體分子，烷基二胺分子為客體分子，構建了一系列基于準輪烷分子的pH 響應性分子機器[30]。CB[6]能夠與雙質子化的二胺分子形成穩定的1∶1 主客體復合物，但是當烷基二胺分子中的兩個氮原子處于單質子化和去質子化狀態時，CB[6]與其的結合常數顯著下降。這就是這類分子機器具有pH響應性質的原因。

受到上述工作的啟發，本文希望利用含有高活性GPx 催化中心的有機碲化合物與CB[6]分子構建具有pH 響應的分子機器，從而獲得pH 敏感性GPx人工酶。合成了乙胺單碲醚（化合物I），當兩個氨基均被質子化時，乙胺單碲醚可以與CB[6]復合形成分子機器，此時催化中心被包埋在CB[6]的疏水空腔之中無法接觸到底物，因此不能充分展現GPx活力。當兩個氨基隨著pH 的升高逐漸變為單質子化和去質子化時，分子機器逐漸分解，活性中心逐漸從CB[6]的疏水空腔之中釋放出來，GPx 活力也隨之逐漸顯現（圖1）。通過調節體系的pH 來控制分子機器的形成與分解，可實現對人工酶活性的可逆調控，從而構建高活性pH敏感性GPx人工酶。

圖1 利用分子機器的組裝與分解構建pH敏感性谷胱甘肽過氧化物人工酶示意圖Fig.1 Schematic representation of pH sensitive artificial glutathione peroxidase based on the formation and dissociation of molecular machine

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

2-溴乙胺氫溴酸鹽（C2H6NH2Br·HBr，99%）、二氯甲烷（DCM，分析純）、乙酸乙酯（EAT，分析純）、硼氫化鈉（NaBH4，98%）、三氟乙酸（TFA，99%）、碲粉（Te，99.99%）購自安徽澤升科技有限公司，四氫呋喃（THF，分析純）、三乙胺（(C2H5)3N，99%）、無水甲醇（MAL，分析純）、乙醚（C4H10O，分析純）購自上海國藥集團化學試劑有限公司，二碳酸二叔丁酯（BOC，98%）購自北京百靈威科技有限公司，碳酸氫鈉（NaHCO3，分析純）、氯化鈉（NaCl，分析純）、無水硫酸鈉（Na2SO4，分析純）購自天津市大茂化學試劑廠。

BRUKERAM-500 核磁共振儀，德國Bruker 公司；SHIMADZU 2450 紫外可見分光光度計，日本島津公司；C-MAGHS7digital 數顯型磁力攪拌器，廣州儀科實驗技術有限公司；N-1300 旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；CA-1116A 冷卻水循環裝置，上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；2XZ-4旋片真空泵，鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 乙胺單碲醚（I）的合成

合成路線如圖2所示。向500 ml單口圓底燒瓶中依次加入2-溴乙胺氫溴酸鹽（Ⅱ, 20 g, 97.6 mmol）、三乙胺（70 ml）以及四氫呋喃（100 ml），將二碳酸二叔丁酯（23.5 g, 107.36 mmol）溶解于四氫呋喃（100 ml）并滴加至圓底燒瓶中，在室溫反應12 h。反應結束后減壓將體系中的四氫呋喃除去，之后將產物溶解于200 ml 二氯甲烷中，分別使用0.1 mol·L-1鹽酸、50 g·L-1的NaHCO3溶液以及飽和NaCl溶液各萃取二氯甲烷溶液三次，使用旋轉蒸發儀除去有機相，得到18.6 g 無色透明液體產物Ⅲ，產率85%。1H NMR(CDCl3;500 MHz),δ:1.46(s,9H,C(Me)3),3.46(t,2H,BrCH2),3.54(q,3H,NCH2)。

圖2 乙胺單碲醚（化合物I）的合成路線圖Fig.2 Synthesis procedures of compound I

使用無水甲醇（50 ml）將化合物Ⅲ（5.9 g, 26.4 mmol）溶解，通入氮氣30 min 以除去體系中的氧氣。向250 ml圓底燒瓶中分別加入碲粉（3.7 g,29 mmol）以及硼氫化鈉（1 g,26.4 mmol），反復三次減壓并通入氮氣除去反應體系中的氧氣，之后將不含氧氣的水（30 ml）加入體系中升溫至80℃反應30 min 生成Na2Te2。反應溶液冷卻至室溫后將化合物Ⅲ的甲醇溶液加入到體系中，室溫攪拌反應12 h。反應結束后使用二氯甲烷萃取三次，使用旋轉蒸發儀將二氯甲烷除去，通過柱色譜法將反應產物提純[硅膠，二氯甲烷/乙酸乙酯=15/1(體積比)作為洗脫劑]，得到2.9 g 黃色粉末狀固體產物Ⅳ，產率40%。1H NMR(DMSO; 500 MHz; Me4Si),δ: 1.37 (s, 18H, 2C(Me)3),3.08 (t, 4H, TeCH2), 3.20 (t, 4H, NCH2);13C NMR(DMSO; 500 MHz),δ: 155.78, 78.13, 44.50, 40.03,28.74;ESI-MS,m/z:586.28[M+K]+。

分別使用無水甲醇（50 ml）將化合物Ⅲ（4.13 g,18.5 mmol）及化合物Ⅳ（2 g,3.7 mmol）溶解，通入氮氣30 min 以除去體系中的氧氣。向250 ml 圓底燒瓶中加入硼氫化鈉（0.7 g, 18.5 mmol），反復三次減壓并通入氮氣除去反應體系中的氧氣，之后將上述化合物Ⅳ甲醇溶液加入到圓底燒瓶中，室溫攪拌反應30 min。之后將上述化合物Ⅲ甲醇溶液加入到圓底燒瓶中，室溫持續攪拌反應12 h。待反應結束后，加入100 ml 水并使用二氯甲烷萃取三次，使用旋轉蒸發儀將二氯甲烷除去，通過柱色譜法將反應產物提純(硅膠，二氯甲烷/乙酸乙酯= 15/1 作為洗脫劑)，得到2.2 g 無色透明液體產物V，產率70%。1H NMR(DMSO; 500MHz; Me4Si),δ: 1.37 (s, 18H, 2C(Me)3),2.61 (t, 4H, TeCH2), 3.20 (t, 4H, NCH2);13C NMR(DMSO; 500MHz),δ: 155.78, 78.07, 42.91, 39.95,28.70;ESI-MS,m/z:435.13[M+Na]+。

用10 ml 二氯甲烷將化合物Ⅴ（2.2 g,5.3 mmol）溶解后加入50ml圓底燒瓶中，冰浴保護下將三氟乙酸（5 ml,28.6 mmol）滴加到化合物Ⅴ的二氯甲烷溶液中，滴加完畢后室溫攪拌反應12 h。反應結束后將反應溶液倒入50 ml 飽和碳酸鈉溶液中，使用二氯甲烷萃取三次，之后將二氯甲烷除去，得到580 mg 淡黃色液體產物I，產率50%。1H NMR(D2O;500 MHz; Me4Si),δ: 2.69 (t, 4H, TeCH2), 2.85 (t, 4H,NCH2);13C NMR (D2O; 500 MHz),δ: 42.12, 36.16;ESI-MS,m/z:217.95[M+H]+。

1.3 分子機器組裝與分解的表征

利用1H NMR 滴定實驗驗證分子機器的組裝：將化合物Ⅰ以5 mmol·L-1的濃度溶解在D2O 中，將CB[6]分別以1.25、2.5、3.75 和5 mmol·L-1的濃度溶解在1 mol·L-1KCl 的D2O 溶液中。將化合物Ⅰ與上述不同濃度CB[6]溶液以等比例混合，通過1H NMR測試驗證分子機器的逐漸組裝。

利用1H NMR 研究分子機器在不同pH 條件下的分解情況：將化合物Ⅰ與CB[6]按照1∶1 的比例、5 mmol·L-1的濃度溶于D2O 組裝形成分子機器，利用DCl 和NaOD 調控分子機器溶液的pH 在6～9 范圍內改變，測試不同pH 條件下溶液的1H NMR 譜，研究分子機器在不同pH條件下的分解情況。

1.4 GPx酶學性質的測試

1.4.1 TNB 法測試GPx 活性 TNB 法又稱為直接法，該測試方法將天然GPx 底物谷胱甘肽替換成TNB（3-羧基-4-硝基苯硫酚）作為反應底物，式（1）為其反應方程式。

測試體系總體積設定為500 μl，首先向比色皿中加入濃度為1 mmol·L-1、溶于對應pH 緩沖液中的TNB 溶液50 μl，然后加入所需濃度溶于對應pH 緩沖液中的酶50 μl，再加入200 mmol·L-1的磷酸緩沖液350 μl（pH=6～10）并在37℃下保溫5 min，最后加入50 μl 濃度為2.5 mmol·L-1的H2O2（溶解于去離子水中）啟動反應。通過觀察TNB 在410 nm 紫外-可見光譜吸收值的降低，計算TNB 被H2O2氧化的反應速率。酶活力定義為每分鐘氧化1 μmol TNB 所需酶量，單位是μmol·min-1·μmol-1。

1.4.2 雙酶還原法測試GPx活性 雙酶還原法又稱為間接法，它的測試方法與天然GPx相同，即將谷胱甘肽（GSH）作為底物，并以GSH 還原酶消耗的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）偶聯分析酶學活性，式（2）、式（3）為其反應方程式。

測試體系總體積定為500 μl，首先向比色皿中加入濃度為10 mmol·L-1的GSH 溶液50 μl，谷胱甘肽還原酶（GR，1U）50 μl，所需濃度的酶50 μl 以及50 mmol·L-1的磷酸緩沖液250 μl，在37℃下保溫5 min 后加入50 μl NADPH（溶解于1%的NaHCO3溶液中，濃度為2.5 mg·ml-1），在37℃下保溫5 min后加入50 μl 的H2O2（5 mmol·L-1）啟動反應。通過觀察NADPH 在340 nm 紫外-可見光譜吸收值的降低，計算GSH 被H2O2氧化的反應速率。酶活力定義為每分 鐘 氧 化1 μmol·L-1NADPH 所 需 酶 量，單 位 是μmol·min-1·μmol-1。

2 結果與討論

2.1 化合物I的GPx活性與最適pH

在37℃、pH=7 的條件下，分別利用TNB 法及雙酶還原法對化合物I 的GPx 活性進行了研究。結果表明，兩種方法所得催化曲線的斜率均隨化合物Ⅰ濃度的增加而線性增加（圖3），這符合典型的酶促反應規律。通過計算得到化合物Ⅰ的GPx 活力在TNB 測試法中為（1.46±0.02）μmol·min-1·μmol-1，雙酶還原測試法中為（1.97±0.08）μmol·min-1·μmol-1。經典的有機碲化合物二苯二碲（PhTeTePh）通過TNB 測試法測得的活性為4.6 μmol·min-1·μmol-1，通過雙酶還原測試法測得的活性為0.9 μmol·min-1·μmol-1[15,31-32]。TNB 是一種疏水性較強的底物，二苯二碲帶有兩個疏水性的苯基，與疏水性底物之間具有一定的結合能力，因此在TNB 測試法中二苯二碲的活性比化合物I 高。雙酶還原測試法是最大程度還原生命體內催化反應的測試方法，此方法中的底物是具有良好水溶性的天然酶底物GSH。GSH 帶有羧基，與化合物I 的氨基之間具有靜電相互作用，因此雙酶還原法中化合物I 的活性較高。由于二苯二碲與化合物I 的催化中心相似，且兩種化合物均不具備精確的底物識別位點，僅與不同底物之間具有一定的弱相互作用，因此二者在不同測試體系中活力值的差別不大，均在1 個數量級之內。天然GPx 的活性僅能夠通過雙酶還原法測試，這是由于天然GPx具有底物專一性，僅能夠識別GSH，也正是這種精確識別并結合底物的能力賦予了天然酶極高的催化效率，其比活力高達103μmol·min-1·μmol-1數量級[32-34]。

圖3 化合物Ⅰ濃度分別為0、1、2、4 μmol·L-1條件下的催化曲線Fig.3 Catalytic curves of different concentrations of compound Ⅰby TNB assay system and GSH reductase-reduced NADPH coupled catalytic activity assay system at pH=7 concentrations of compound Ⅰ/(μmol·L-1):a—0;b—1;c—2;d—4

為了進一步研究化合物I 的催化性質，利用TNB 法測試了化合物Ⅰ在不同pH 下的GPx 活性。結果表明，化合物Ⅰ的活性在pH=6、7、8和9時分別為(1.36±0.03)、(1.46±0.02)、(0.68±0.06)和(0.34±0.02)μmol·min-1·μmol-1（圖4）。圖4 直觀地表明了化合物Ⅰ在pH=7時能夠展現出最高的GPx活性。

圖4 化合物Ⅰ在不同pH下的GPx活性Fig.4 Catalytic activities of compound Ⅰat different pHs

2.2 化合物I催化機理及動力學

2.2.1 化合物I 催化雙倒數曲線的測定 為了進一步研究有機化合物Ⅰ的催化機理及酶促反應動力學，通過雙酶還原法測定了其催化雙倒數曲線。測試體系中含有H2O2和GSH 兩種底物，通過固定其中一種底物的濃度，改變另一種底物的濃度，來檢測催化反應對底物濃度的依賴性，進而闡明它的催化動力學機制。將GSH 的濃度分別固定為1.5、2 和4 mmol·L-1，測定H2O2的濃度分別為0.33、0.5 和0.75 mmol·L-1時化合物Ⅰ的GPx 活性，以化合物Ⅰ催化速率的倒數對GSH 濃度的倒數作圖，得到一組相交直線[圖5(a)]。再以化合物Ⅰ催化速率的倒數對H2O2濃度的倒數作圖，同樣得到一組相交直線[圖5(b)]。

圖5 化合物Ⅰ催化GSH還原H2O2的雙倒數曲線Fig.5 Double-reciprocal plots of the reduction of H2O2 by GSH under the catalysis of compound Ⅰ

2.2.2 化合物I 的催化反應機理分析 通過以上研究發現化合物Ⅰ的雙倒數曲線是一系列相交于一點的直線，說明其催化遵循順序機制。順序機制中在最后一步釋放單一產物（GSSG），在釋放產物之前，兩種底物都與酶形成酶-底物復合物[35]。Engman 等[36]推測有機碲化物在催化循環過程中處于氧化態(RTe(OH)2R)。結合文獻[35-36]的研究，推測化合物I的催化反應遵循圖6所示的循環機理。

圖6 化合物Ⅰ可能的催化循環示意圖Fig.6 Proposed catalytic mechanism of compound Ⅰ

2.2.3 化合物I 酶促反應動力學參數的計算 GPx

催化GSH 與H2O2反應的相關穩態方程如式（4）所示：

其中，v0為初始反應速率;[E0]為初始模擬酶濃度；kcat為一級反應速率；KmGSH和KmH2O2分別為GSH 和H2O2的Michaelis-Menten 常數。根據穩態方程和雙倒數曲線計算的化合物Ⅰ的酶促反應動力學參數如表1所示。結果表明，化合物I的二級反應速率常數（kcat/Km）在101L·mol-1·min-1數量級，包括依布硒啉、二苯二硒等在內的經典小分子GPx 人工酶的二級反應速率常數通常在10-2～10-3L·mol-1·min-1數量級[22-23,37]，即化合物I 的二級反應速率常數相較于經典小分子GPx 人工酶提高了2～3個數量級。這是因為經典小分子GPx人工酶的催化中心通常是硒醚結構，跟硒相比碲具有更強的氧化還原能力，在圖6所示催化循環中，碲醚更易被H2O2氧化形成碲醇從而開啟催化循環[31-32,38]。

表1 化合物Ⅰ的表觀動力學參數Table 1 The apparent kinetic parameters of compound Ⅰ

2.3 分子機器的組裝及其pH敏感性

2.3.1 分子機器的組裝 通過1H NMR 滴定實驗測試化合物Ⅰ與CB[6]能否復合形成分子機器。在pH=6時，將CB[6]逐漸加入化合物Ⅰ的溶液中，H1和H2對應的1H NMR 信號峰逐漸消失，隨后出現一組新峰，這組新峰的增長是由于化合物I 的H1和H2被包埋在CB[6]的疏水空腔之中。隨著CB[6]加入量的加大，化合物I 中原有的H1和H2對應的1H NMR 信號峰幾乎完全消失，H1和H2在1H NMR 譜中表現出不同程度的峰移動（圖7）。其中，H1的化學位移從

圖7 化合物Ⅰ(5 mmol·L-1)在pH=6時與不同濃度CB[6]混合物的部分1H NMR譜圖Fig.7 Partial1H NMR spectra of mixtures of compound Ⅰ(5 mmol·L-1)with different amounts of CB[6]at pH=6 concentration of CB[6]/(mmol·L-1):a—5;b—3.75;c—2.5;d—1.25

2.83 移動到1.98，H2的化學位移從3.32 移動到3.07。烷基二胺分子被包埋于CB[6]的疏水空腔中時，限域疏水環境會使亞甲基中H 的化學位移降低。靠近疏水空腔端口的亞甲基中H 的化學位移降低幅度較小，而深入疏水空腔內部的亞甲基中H 的化學位移降低幅度較大[39]。圖7 中的結果與文獻報道相吻合，由此可以推斷在pH=6 時，化合物I 的兩個氨基均處于質子化狀態，能夠與CB[6]形成穩定的1∶1 復合物，從而組裝形成分子機器。根據1H NMR 數據計算出它們之間的結合常數為(4.62±0.24)×103L·mol-1。戊二胺分子含有5 個亞甲基，在尺寸上與CB[6]疏水空腔的匹配度最高，二者的結合常數高達2.40×106L·mol-1[40]。當中間的碳原子被硫原子取代后，硫原子半徑較碳原子的大，與CB[6]疏水空腔的匹配度降低，因此H2N(CH2)2S(CH2)2NH2分子與CB[6]的結合常數下降了1 個數量級至4.2×105L·mol-1[40]。當硫原子進一步被同主族尺寸更大的硒原子取代后，與CB[6]疏水空腔的匹配度再次降低，根據文獻[23]報道，H2N(CH2)2Se(CH2)2NH2分子與CB[6]的結合常數下降1 個數量級至2.5×104L·mol-1。當硒原子被同主族尺寸更大的碲原子取代后，與CB[6]疏水空腔的匹配度進一步降低，因此化合物I 與CB[6]的結合常數進一步下降1 個數量級。但是化合物I 與CB[6]的結合常數依然處于103L·mol-1數量級，足以保證與CB[6]形成穩定的復合物。

2.3.2 分子機器的pH 敏感性 隨著pH 的升高，化合物Ⅰ的兩個氨基逐漸由雙質子化轉變為單質子化甚至是去質子化，因而與CB[6]的結合能力也逐漸降低，分子機器會逐漸分解。通過1H NMR 滴定實驗對分子機器的分解進行了表征。結果表明，隨著體系pH 的升高，分子機器形態的化合物Ⅰ的1H NMR 信號峰逐漸降低，隨后游離態化合物Ⅰ的峰增加，說明分子機器隨著pH 的升高逐漸分解（圖8）。分析1H NMR 譜中剩余分子機器和從分子機器中解離下來的H1和H2信號峰的積分比，得到pH 為7 和9時分別有約24%和65%的分子機器發生了分解。以上實驗結果表明，化合物Ⅰ與CB[6]分子構建的分子機器具有一定的pH 敏感性，可以利用pH 調控其形成與分解。

圖8 化合物Ⅰ(5 mmol·L-1)與CB[6](5 mmol·L-1)在不同pH下的部分1 H NMR 譜圖(500 MHz)Fig.8 Partial1H NMR spectra(500 MHz)of mixtures of compound Ⅰ(5 mmol·L-1)with CB[6](5 mmol·L-1)at different pH

2.4 智能GPx人工酶的構建及其pH敏感性

2.4.1 分子機器的組裝對GPx 活性的影響 pH=6時，化合物Ⅰ與CB[6]分子能夠組裝形成分子機器，通過TNB 測試體系研究了分子機器的組裝過程對GPx 活性的影響。將化合物Ⅰ的濃度固定為4 μmol·L-1，分別將1、2、3 和4 μmol·L-1的CB[6]加入到體系之中。結果表明，隨著CB[6]加入量的增大，催化曲線的斜率逐漸減小，即GPx活性逐漸減小（圖9）。當加入1∶1 的CB[6]時，化合物Ⅰ與CB[6]分子完全組裝形成分子機器，此時幾乎無法展現GPx 活性[僅為(0.04±0.02)μmol·min-1·μmol-1]，相比未加入CB[6]時下降了一個數量級。這是因為隨著分子機器的組裝，單碲醚活性中心被包埋在CB[6]的空腔之中，無法接觸到溶液中的反應物，從而無法展現其催化活性。

圖9 pH=6時4 μmol·L-1化合物Ⅰ與空白（a）,及濃度分別為4 μmol·L-1（b）、3 μmol·L-1（c）、2 μmol·L-1（d）、1 μmol·L-1（e）、0 μmol·L-1（f）的CB[6]混合物的催化曲線Fig.9 Catalytic curves of mixture of 4 μmol·L-1 compound Ⅰand blank(a),4 μmol·L-1(b),3 μmol·L-1(c),2 μmol·L-1(d),1 μmol·L-1(e),0 μmol·L-1(f)CB[6]at pH=6

2.4.2 不同pH 下分子機器的GPx 活性 化合物Ⅰ與CB[6]分子組裝形成分子機器后，通過TNB 體系測試了不同pH 下分子機器的催化曲線（圖10）。結果表明，當pH=6 時，分子機器幾乎無法展現GPx 活性[圖10(a)]，這是因為氨基處于質子化狀態，CB[6]與其結合能力較強，單碲醚活性中心被包埋在CB[6]的空腔之中。隨著體系pH 的升高，由于氨基的去質子化，化合物Ⅰ與CB[6]分子的結合能力下降，分子機器逐漸分解。pH=7 時[圖10(b)]，隨著分子機器逐漸開始分解，單碲醚活性中心開始暴露于溶液底物之中，能夠展現出24%的GPx 活性[(0.35±0.06)μmol·min-1·μmol-1]。pH=8 時[圖10(c)]，分子機器進一步分解，已經能夠展現出40%的GPx 活性（0.26 μmol·min-1·μmol-1），雖然較pH=7 時展現出更高百分比的活性，但是活性的絕對值較pH=7 時稍低，這是因為化合物Ⅰ的最適pH 為7，pH=8 時的活性較pH=7 時有明顯下降。pH=9 時[圖10(d)]，分子機器更進一步分解，能夠展現出65%的GPx 活性（0.21 μmol·min-1·μmol-1），雖然展現出活性的百分比進一步提高，但是由于pH=9 時化合物Ⅰ活性進一步下降，導致活性的絕對值較pH=8時進一步降低。

圖10 分子機器的催化曲線Fig.10 Catalytic curves of molecular machine

將不同pH 下分子機器催化活性的相對值與絕對值整理為柱狀圖示于圖11。由圖11可以看出，利用分子機器的形成與分解，人工酶的活性能夠可控地在pH=6 時關閉，在pH=7 時開啟。目前pH 敏感性GPx人工酶在可控開啟時展現出的活性僅能達到10-3μmol·min-1·μmol-1數量級[22-23]，而本文成功構建了高活性的pH敏感性GPx人工酶，可控開啟時能夠展現出10-1μmol·min-1·μmol-1數量級的活性，較文獻報道中的活性提高了2個數量級。以上實驗結果表明，本文基于含碲醚催化中心的分子機器，構建了高活性的pH敏感性GPx人工酶，且能夠在接近生命體內pH 水平的范圍內調控人工酶活性的關閉與開啟，為構建pH敏感性GPx人工酶提供了新的方法和思路。

圖11 pH在6～9時分子機器催化活性的相對值(a)及分子機器催化活性的絕對值(b)Fig.11 Relative catalytic activities(a)and catalytic activities(b)of the molecular machine at a range of pH from 6 to 9

3 結 論

(1)設計并合成了含有單碲醚活性中心的乙胺單碲醚分子（化合物Ⅰ），測定了其GPx 催化動力學常數，推測出其催化機理為順序機制。

(2)利用1H NMR 證明了pH≤6 時乙胺單碲醚可以與CB[6]分子組裝形成分子機器，pH≥7時，分子機器會逐漸分解，其分解比例在pH 為7 和9 時分別為24%和65%。

(3)組裝形成分子機器后，乙胺單碲醚分子的活性中心被包埋在CB[6]的疏水空腔中，幾乎無法展現活性[（0.04±0.02）μmol·min-1·μmol-1]，升高pH 使得分子機器部分分解后，活性中心被釋放到溶液之中，能 夠 展 現 部 分 活 性[（0.35±0.06）μmol·min-1·μmol-1]。通過調控分子機器在pH為6和7之間的形成與分解，可以調控人工酶的關閉與開啟，從而成功構建了pH敏感性GPx人工酶。

(4)大幅提高了pH 敏感性GPx 人工酶可控開啟時展現出的活性，拓展了GPx人工酶的潛在應用，并且為構建pH敏感性人工酶提供了新的思路。

符 號 說 明