白芷提取物及其活性成分歐前胡素改善痛風性關節炎

元明慧，姜禹辰，廉麗花，南極星，吳艷玲

(延邊大學藥學院，吉林 延吉 133002)

痛風性關節炎(gouty arthritis)是一種典型與多種因素交叉的代謝性疾病，主要臨床特征是尿酸鹽結晶沉積和高尿酸血癥。根據不同的類型和嚴重程度分為急性痛風性關節炎、痛風石關節炎和慢性痛風石關節炎。嚴重的患者可能出現尿路結石、關節功能障礙、腎功能衰竭等并發癥[1-2]。目前臨床上治療痛風性關節炎的常規藥物主要包括秋水仙堿、非甾體抗炎藥等，這些藥物在使用過程中常常伴有不良反應而限制了在臨床上的應用[3]。因此，研究效果好、毒性低的抗痛風藥物是目前藥學研究的重要方向之一。

白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm.)Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav，AD]的干燥根，主要含有香豆素類、揮發油類、苷類、生物堿類等多種化學成分，現代藥理學研究表明，白芷具有抗菌、抗氧化、抗炎、保護神經和鎮痛效果[4-5]。臨床廣泛應用于頭痛、牙痛、風濕痹痛、瘡瘍腫痛等病癥。有許多治療痛風性關節炎的外用中藥制劑配方中都含有白芷[6]。說明白芷具有治療痛風的作用，但未見單一用藥治療痛風的相關報道。歐前胡素(imperatorin，IM)是白芷中一種主要的香豆素類化合物，其藥理作用與白芷相似，具有抗癌、神經保護、抗炎、抗高血壓和抗菌的作用[7]。有研究發現，歐前胡素可以減輕膠原誘導的大鼠類風濕性關節炎[8]。本文采用尿酸鈉(monosodium urate， MSU)晶體誘導痛風性關節炎動物模型，觀察AD和IM對MSU誘導的痛風性關節炎大鼠左踝關節腫脹度和滑膜組織中炎性浸潤情況，以及滑膜組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1、IL-1R1、IL-6、TNF-α含量的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物及試劑本實驗所用白芷購于延邊葉琳參茸藥品有限公司，產地為四川。歐前胡素購于成都德銳可生物科技有限公司(批號：drk-1184-940126)。秋水仙堿購于成都德銳可生物科技有限公司(批號：drk-1161-950118)。尿酸鈉購于SIGMA公司(批號：BCBS7438)。Anti-GAPDH(ab8245)、Anti-NLRP3(ab181389)購自Abcam；Anti-IL-1R1(sc-393998)、Anti-IL-1β(sc-32294)、Anti-IL-6(sc-28343)、Anti-caspase-1(sc-622)購自Santa Cruz；BCA試劑盒(Beyotime)；RNA總提取試劑盒(Promega)；中性樹膠(國藥集團化學試劑)。

1.2 實驗儀器化學成像發光顯色儀(Tanon)；全自動倒置電泳儀、轉印電泳槽、電泳儀、轉印電泳槽(BIO-RAD)；水平搖床、低溫超速離心機、酶標儀(Bio Tek)；Mastercycler PCR儀(Eppendorf)；凝膠成像分析儀(BIO-RAD)；Mini離心機、磁力加熱攪拌器(IKA)；高速冷凍離心機(HITACHI)；石蠟包埋機、轉輪切片機(Leica)。

1.3 動物SD大鼠，♂，體質量(200～220) g，SPF級，由延邊大學實驗動物中心提供，動物許可證號SYXK(吉)2020-0010，適應性喂養1周后開始實驗。

1.4 白芷提取物的制備取白芷藥材50 g，加入75%乙醇500 mL，浸泡24 h，在80 ℃水浴中回流提取3 h，過濾，回流提取2次，收集濾液，60 ℃旋轉蒸發濃縮至浸膏，冷凍干燥成凍干粉，即為白芷提取物。

1.5 尿酸鈉晶體(MSU)的制備將800 mg尿酸鈉和5 mL NaOH(1 mol·L-1)加入155 mL去離子水煮沸，完全溶解，攪拌降至室溫，用1 mol·L-1HCl調pH至7.0，3 000 r·min-1離心2 min，4 ℃冷卻1 h后離心，d 2抽濾，收集晶體，4 ℃保存。

1.6 實驗動物分組與造模SD大鼠隨機分為7組，每組5只，即為正常組、模型組、AD低、高劑量組(800、1 200 mg·kg-1)、IM低、高劑量組(20、40 mg·kg-1)、秋水仙堿組(0.8 mg·kg-1Colchicine， COL)。AD和IM各組連續灌胃給藥7 d。d 7 秋水仙堿組灌胃給藥一次。d 8除正常組外，其余各組均用乙醚麻醉，將0.2 mL MSU溶液(取0.5 g MSU溶于9 mL生理鹽水加入適量吐溫充分溶解)注射到左踝關節腔內造模。24 h后，大鼠進行安樂死，收集滑膜組織。

1.7 大鼠左踝關節腫脹度的測量每組大鼠分別在造模前(0 h)和造模后2～24 h，測量大鼠左踝關節同一部位的周長，測量3次，取平均值。

1.8 Western bolt檢測滑膜組織中炎性因子的蛋白含量取滑膜組織，加入RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑)勻漿機勻漿10 min，5 000 r·min-1離心10 min，BCA法測定蛋白含量，以GAPDH為內參，進行western blot檢測，測定蛋白相對含量。

1.9 RT-PCR檢測滑膜組織中炎性因子mRNA的表達用RNA提取試劑盒從滑膜組織提取總RNA，用所需的基因引物進行RT-PCR過程，通過凝膠成像分析儀不同曝光時間進行拍照分析。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer and sequences

1.10 HE染色觀察滑膜組織病理學變化將滑膜組織多聚甲醛固定后，3%硝酸脫鈣8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后，用蘇木素和伊紅對切片進行染色，最后在顯微鏡下觀察并采圖。

2 結果

2.1 AD和IM對MSU誘導的痛風性關節炎大鼠左踝關節腫脹度的影響與正常組相比，大鼠左踝關節出現明顯腫脹(Fig 1)，造模2 h腫脹達到高峰(P<0.05)。與模型組相比，AD、IM和COL組的大鼠左踝關節腫脹逐漸得到緩解，見Tab 2。

Fig 1 Left ankle joints of each group after injection of MSU 24 h

Tab 2 Effect of AD and IM on ankle swelling induced by MSU of )

2.2 AD和IM對滑膜組織病理形態的變化正常組滑膜組織中滑膜細胞排列整齊，沒有炎性細胞浸潤；模型組滑膜組織中炎性細胞浸潤明顯，并伴有纖維蛋白滲出，滑膜組織增生，滑膜層增厚；AD、IM和COL組滑膜細胞的炎性細胞浸潤和滑膜組織增生均有不同程度的減輕，見Fig 2。

Fig 2 Effect of AD and IM on synovial histopathology of MSU induced gouty arthritis

2.3 AD和IM對滑膜組織中炎性因子的影響如Fig 3，4所示，與正常組相比，MSU誘導痛風性關節炎大鼠的滑膜組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1的蛋白和mRNA表達均明顯高(P<0.01)。同時促進IL-1R1、IL-6、TNF-α蛋白或mRNA表達(P<0.01)。給予AD、IM和COL后NLRP3、IL-1β、caspase-1的蛋白和mRNA表達水平降低(P<0.01，P<0.01)，且可以降低炎性因子IL-1R1、IL-6、TNF-α的蛋白或mRNA的表達(P<0.01)。

Fig 3 Effect of AD and IM on content of NLRP3， caspase-1， IL-1β， IL-6， IL-1R1 protein

Fig 4 Effect of AD and IM on content of NLRP3， caspase-1， IL-1β， IL-6， IL-1R1， TNF-α mRNA

3 討論

痛風性關節炎在臨床上以關節劇痛伴腫脹發熱暗紅為主要表現。白芷始載于《神農本草經》，被列為中品，在我國有著悠久的藥食兩用的歷史。白芷中主要含有的有效成分為香豆素類和揮發油類，除此之外，還含有香豆素苷類、微量元素、多糖等多種有效成分[5]。白芷因其消腫止痛、祛風除濕的作用，常與其他清熱解毒、消腫止痛的藥物配伍應用與治療痛風性關節炎的外用制劑。臨床研究證實了白芷與清熱解毒、活血通絡藥物配伍治療痛風性關節炎可起到一定的作用，有其獨特的配伍特點[6]。臨床及科研中單獨用白芷治療痛風性關節炎的研究少見。現代藥理學研究中白芷的鎮痛抗炎主要成分與總香豆素和揮發油類有關，歐前胡素是香豆素中主要的活性成分。有研究顯示，歐前胡素和β-谷甾醇聯合應用可協同緩解膠原誘導大鼠類風濕性關節炎的嚴重程度，其機制與靶向LTA、CD83和SREBF1密切相關[8]。西藥長期服用不良反應發生率高，目前還沒有解決尿酸鹽沉積這個問題的有效治療手段。中醫學在防治痛風方面有著長期的臨床實踐和大量的臨床經驗，療效獨特，但其藥理機制尚不明確，限制了臨床應用和推廣。目前臨床上治療痛風的有效藥物分為兩類，一是促進尿酸排泄的藥物，如苯溴馬隆、丙磺舒等；二是抑制尿酸產生的藥物，如秋水仙堿、非甾體抗炎藥、促腎上腺素皮質激素、糖皮質激素等。但這些藥物常常伴有消化系統損害和肝腎毒性等不良反應[9]。本研究中選取秋水仙堿為陽性對照藥物。結果顯示，AD和IM可以減輕MSU誘導大鼠痛風性關節炎左踝關節腫脹程度；降低滑膜組織中炎性物質的滲出，抑制滑膜層增厚。綜上所述，AD和IM可以有效治療MSU誘導的痛風性關節炎。

痛風性關節炎由尿酸鈉結晶沉積在關節及關節周圍組織，并與滑膜中免疫球蛋白結合，炎癥細胞聚集引起的炎癥反應，進而促使單核細胞產生IL-6、IL-1β等多種炎性因子。尿酸鈉晶體注射踝關節腔后可導致受試關節周徑明顯增大，腫脹嚴重[10-11]。IL-1β被認為是尿酸鈉結晶誘導炎癥的關鍵因子，在痛風性關節炎的滑膜，滑液軟骨等關節組織中大量存在[12]。IL-6主要由巨噬細胞、T細胞等多種細胞產生，痛風性關節炎期間IL-6水平升高，可作為判斷痛風性關節炎嚴重程度的指標[13]。TNF-α可增加中性粒細胞的募集，上調內皮細胞選擇素活性，使中性粒細胞和 內皮細胞表面的黏附分子結合，為促炎癥介質，可對局部產生浸潤，導致炎性介質釋放，引起關節局部出現紅腫熱痛等炎癥反應[14]。NLRP3是NLRs受體家族中的重要亞族之一，主要由B淋巴細胞和T淋巴細胞等產生。 NLRP3作為胞內模式識別受體，識別病原相關分子模式和危險相關分子模式。如MSU、SiO2、CPPD、胞外ATP等危險信號分子，可作為配體被NLRP3識別，使NLRP3發生蛋白寡聚化，并招募銜接蛋白凋亡相關斑點樣蛋白和caspase-1，組裝成NLRP3炎性體，最終活化效應蛋白caspase-1[15]。由此可見，上述炎癥因子在痛風性關節炎中發揮著至關重要的作用，因此抑制它們的產生并阻斷炎癥反應的發生，對緩解痛風性關節炎有重要意義。本研究結果表明，AD和IM可以顯著抑制MSU導致的炎癥反應，進而緩解痛風性關節炎。綜上所述，白芷提取物和歐前胡素在抗痛風性關節炎方面有明顯的緩解作用，可以作為治療MSU誘導的痛風性關節炎的有效藥物，但作用機制還需進一步研究。