基于NF-κB/MAPK信號通路探討天山堇菜七葉內酯對脂多糖誘導RAW 264.7細胞的保護作用及機制

王 雪，劉 燕，史玉柱

(新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830011)

天山堇菜(ViolatianshanicaMaxim)又名“比那夫西”，是堇菜科(Violaceae)堇菜屬植物，藥用其干燥全草，具有調理、軟化、發汗的作用。臨床用于熱性感冒、發燒、頭痛、咽痛、肢腫、小兒驚厥，也可外用于疔瘡腫痛等癥[1-2]。全草含揮發油、黃酮類、生物堿、氨基酸、皂苷、鞣質、香豆素等成分，具有明顯的抗菌、抗氧化等作用[1-3]。天山堇菜在維吾爾藥經典名方中存在著廣泛的應用，它是常用的單方退燒藥或復方抗病毒藥的主要組分。如：復方天山堇菜顆粒、降熱比那甫西糖漿、復方比那甫西丸、比那甫西顆粒等，以上經典名方的君藥均為天山堇菜。因其副作用低，價格低廉，是一味極具有研究開發價值的藥材。目前，有關天山堇菜及其化學成分藥理作用及機制方面的深入研究相對比較匱乏。課題組前期研究[3-5]發現，天山堇菜總黃酮提取物具有較好的體內、外抗流感病毒作用及抗炎、免疫調節作用。通過化學成分分析發現天山堇菜總黃酮提取物中含有大量的七葉內酯，采用反相硅膠和Sephadex LH-20色譜技術對天山堇菜中的七葉內酯進行分離純化，最終得到了含量大于97%的七葉內酯。七葉內酯有可能是天山堇菜總黃酮提取物發揮抗炎和免疫調節作用的物質基礎。盡管七葉內酯是一個常見的化合物，普遍存在于很多中藥材中，具有抗菌、抗炎、鎮咳、祛痰、平喘等功效，但對其藥理作用的研究都不夠深入。因此，本研究采用大腸桿菌脂多糖(LPS)誘導小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)急性炎癥模型考察七葉內酯的抗炎作用，探討其是否通過調節NF-κB、MAPK信號通路發揮抗炎作用的機制，為天山堇菜的應用研究與開發提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑天山堇菜七葉內酯，由新疆維吾爾自治區藥物研究所植物化學研究室制備，純度97%；陽性對照藥：吲哚美辛(Indomethacin，INDO)購于美國Sigma公司，貨號：I7378。脂多糖(LPS，Escherichia Coli 055：B5)，美國Sigma公司，貨號L2880；RPMI 1640培養基，Gibco公司，貨號：C11875500CP，批號：8118002；胎牛血清FBS，美國Gibco公司，貨號：10099-141，批號：19083660C；CellTiter 96?AQueous One Solution Cell Proliferation Assay，美國Promega公司，貨號：G3581；Griess試劑盒，碧云天公司，貨號：S0021；Mouse TNF-α ELISA Ready-SET-GO、Mouse IL-6 ELISA Ready-SET-Go，購于Thermo Fischer Scientific 公司，貨號分別為：88-7324-88，88-7064-88；IL-1β酶聯免疫試劑盒，批號：Z13019384，購自武漢華美生物技術有限公司；多聚甲醛購于天津南開允公合成技術公司，貨號：30525-89-4；Triton X-100，Thermo Fischer Scientific公司，貨號：8511；BSA，美國Sigma公司，貨號：A1933；BCA蛋白濃度測定試劑盒(BCA Protein Assay Kit)，CatNo. P00125，Lot No. 052319190910，碧云天生物技術有限公司；iNOS抗體，p-p44/42(ERK1/2) (Thr202/Tyr204)抗體，美國CST公司，貨號：4370S；p-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)抗體，美國CST公司，貨號：9211S；p-NF-κB p65 (Ser536)抗體，美國Abcam公司，貨號：3033S；IκBα (E130)抗體，美國Abcam公司，貨號：ab32518；Hoechst 33342核染料，日本東仁化學公司，貨號：H342；熒光二抗Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG或Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG，Thermo Fischer Scientific 公司，貨號：A11035或A11030。RNAprep pure Cell kit(DP430)，Lot U9012；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(KR118)，Lot W9318；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)，Lot U9208，購自天根生物技術有限公司。COX Fluorescent Inhibitor Screening Assay Kit，批號：0520422，購自Cayman Chemical Company。

1.2 儀器CO2細胞培養箱，Thermo Fischer Scientific公司，型號：LS-C0150；多功能酶標儀，瑞士TECAN公司，型號：SPARKTM20M；Molecular Devices，Spectramax M2, CA, USA；Cellomics Arrayscan高內涵細胞分析系統，Thermo Fischer Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1細胞培養與細胞活力的檢測 RAW 264.7細胞(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞)，購自國家實驗細胞資源共享服務平臺(China infrastructure of cell line resource)，細胞采用含10%胎牛血清，100 kU·L-1青霉素和鏈霉素的RPMI 1640培養基培養，培養條件是飽和濕度，37 ℃，5% CO2。細胞呈對數增長時進行傳代，調整細胞濃度至2×108個·L-1，接種100 μL于96孔培養板，細胞達到80% 融合時撤去血清繼續培養12 h，然后加入AESN(終濃度為100、20、4、0.8、0.16 μmol·L-1)和陽性對照藥吲哚美辛(INDO，10 μmol·L-1)孵育48 h，培養結束時每孔加入MTS溶液10 μL，于37 ℃繼續孵育1.5 h，采用微孔板檢測儀M2檢測490 nm處的光吸收值。

細胞存活率/%=(ODsample-ODblank)/(ODcontrol-ODblank)×100%。

1.3.2AESN對細胞上清中炎癥介質一氧化氮(NO)水平的影響 將RAW 264.7細胞以2×104個/孔的密度接種在96孔板中，孵育18 h后換上無血清的RPMI 1640培養液。設空白對照組，LPS模型組，AESN給藥組(20、4、0.8、0.16 μmol·L-1)以及陽性對照藥吲哚美辛(INDO，10 μmol·L-1)組，給藥組分別加入相應濃度的AESN和INDO，空白對照組與模型組加入同體積無血清RPMI 1640培養液，孵育1 h后，除空白對照組外，各組加入終濃度為1 mg·L-1的LPS繼續孵育24 h，培養結束時取100 μL上清，參照文獻[6]將細胞上清與Griess試劑等體積混合，10 min后檢測OD540的值。

1.3.3AESN對炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β釋放的影響 將RAW 264.7細胞以2×104個/孔的密度接種在96孔板，分組、加藥及加LPS同“1.3.2”，加入LPS孵育24 h后，收集細胞上清，按照ELISA試劑盒說明書的方法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.3.4AESN對iNOS蛋白表達的影響 細胞接種、分組及給藥同“1.3.2”，藥物孵育1 h后，除空白對照組外，每孔加入終濃度為1 mg·L-1的LPS繼續孵育24 h，孵育結束棄去上清，按照100 μL/孔加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，棄去，并用PBS清洗3次；再按照100 μL/孔加入0.25% Triton X-100打孔液室溫作用15 min，PBS清洗3次；再加入100 μL/孔3% BSA封閉液封閉45 min后，棄去封閉液，加入Anti-iNOS抗體(1 ∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，次日用PBS清洗3次，加入含Hochest 33342的山羊抗兔熒光二抗(1 ∶800稀釋)，室溫避光孵育2 h，PBS清洗3次，于Cellomics Arrayscan高內涵細胞分析系統檢測分析。

1.3.5AESN對NF-κB通路、MAPK信號通路的影響 細胞接種、分組同“1.3.2”，提前加入化合物AESN(0.16、0.8、4、20 μmol·L-1)和陽性藥吲哚美辛(10 μmol·L-1)孵育4 h，其它組別平行加入10 μL/孔PBS；向細胞中加入終濃度1 mg·L-1LPS孵育15 min檢測IκBα的降解、孵育30 min檢測p-p65核內表達，孵育45 min檢測p-p38、p-ERK1/2核內的表達。細胞處理結束后，按照100 μL/孔加入4%多聚甲醛室溫固定20 min，棄去并用PBS清洗3次；再按照100 μL/孔加入0.25 % Triton X-100打孔液室溫作用15 min，PBS清洗3次；再加入100 μL/孔3% BSA封閉液封閉45 min后，棄去封閉液，分別加入：anti-IκBα抗體、anti-p-p65抗體、anti-p-p38抗體、anti-p-ERK1/2抗體，以上抗體均按1：1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；次日用PBS清洗3次后加入含Hochest 33342的山羊抗兔(或抗鼠)熒光二抗(1：800稀釋)，室溫避光孵育2 h，PBS清洗3次，于Cellomics Arrayscan高內涵細胞分析系統檢測分析。

1.3.6AESN對TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達的影響 將處于對數生長期的RAW 264.7細胞按照2×106個/皿接種于直徑為6 cm的一次性無菌平皿中，設空白對照組，LPS模型組，AESN給藥組(20、4、0.8、0.16 μmol·L-1)，以及陽性對照藥吲哚美辛(INDO，10 μmol·L-1)組，每組每個濃度3個重復，藥物孵育1 h后，除空白對照組外，各組加入終濃度為1 mg·L-1的LPS繼續孵育24 h，棄上清，按照RNA prep pure Cell kit(DP430)培養細胞總RNA提取試劑盒說明書的方法提取細胞總RNA，對提取的總RNA樣品進行定量并保存于-80 ℃。按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix(KR118)，cDNA第一鏈合成預混試劑合成cDNA并保存于-20 ℃。設計并合成特異引物如Tab 1。

使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(FP205)熒光定量預混試劑，反應體系為20 μL。反應條件為：預變性95 ℃，15 min；40 cycles of：變性95 ℃，10 s；退火60 ℃，20 s；延伸72 ℃，32 s。qRT-PCR相對定量結果計算方法采用SybrGreen ER熒光檢測系統，對目的基因進行相對定量分析，采用看家基因β-actin作為內參照對Ct值進行歸一化處理，基因表達差異計算方法采用2-△△Ct法。

1.3.7AESN對COX-1、COX-2酶活性的影響 AESN對COX-1、COX-2活性的抑制作用按照試劑盒COX fluorescent inhibitor screening assay kit方法進行操作，并計算半數抑制濃度IC50。

2 結果

2.1 AESN對RAW264.7細胞活力的影響由Fig 1可見，AESN孵育48 h后，與空白對照組細胞活力相比較，AESN在0.16～20 μmol·L-1以及10 μmol·L-1吲哚美辛均未出現細胞增殖或毒性作用，僅在100 μmol·L-1出現明顯的細胞毒性作用(P<0.01)。因此，后續實驗選定0.16、0.8、4、20 μmol·L-1作為AESN的實驗劑量。

Fig 1 Effects of AESN on cell

2.2 AESN對LPS誘導RAW264.7細胞產生NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的影響實驗結果顯示，給予1 mg·L-1LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS模型組NO、TNF-α、IL-6、IL-1β分泌量明顯增加(Fig 2 A～D，P<0.01)，AESN各劑量給藥組對NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌量均具有明顯抑制作用且呈劑量依賴性(Fig 2 A～D，P<0.05,P<0.01)。陽性對照藥吲哚美辛(10 μmol·L-1)也能夠明顯抑制NO、TNF-α、IL-6、IL-1β的分泌(Fig 2 A～D，P<0.05或P<0.01)，作用不如AESN的20 μmol·L-1劑量組明顯。

2.3 AESN對TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達的影響實驗結果顯示，給予1 mg·L-1LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS模型組TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達水平明顯增加(Fig 3 A～D，P<0.01)，AESN各劑量給藥組對TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS mRNA表達水平均具有明顯抑制作用(Fig 3 A～D，P<0.01)。陽性對照藥吲哚美辛(10 μmol·L-1)也能夠明顯抑制TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的mRNA表達水平(Fig 3 A～D，P<0.05,P<0.01)，作用不如AESN劑量組明顯。

2.4 AESN對iNOS蛋白表達的影響由Fig 4可見，給予1 mg·L-1LPS刺激24 h后，與Control組相比，LPS模型組iNOS蛋白熒光強度明顯增強(P<0.01)，AESN各劑量給藥組均能明顯減弱iNOS蛋白表達熒光強度(P<0.01)。陽性對照藥吲哚美辛(10 μmol·L-1)也能夠明顯減弱iNOS蛋白的熒光強度(P<0.01)，作用不如AESN 20 μmol·L-1劑量組明顯。

Fig 4 Effects of AESN on iNOS protein expression induced by LPS in RAW 264.7 cells

2.5 AESN對NF-κB信號通路的調節作用由Fig 5可見，給予1 mg·L-1LPS刺激15 min時，LPS模型組IκBα蛋白與Control組相比顯著降解(Fig 5B、D，P<0.01)，LPS刺激30 min時，LPS模型組p-p65核轉位明顯增加(Fig 5A、C，P<0.01)，而AESN在0.16～20 μmol·L-1對IκBα蛋白降解和p-p65核轉位具有明顯抑制作用(P<0.01)，并呈劑量依賴性；吲哚美辛(10 μmol·L-1)也能夠抑制IκBα降解及p-p65核轉位(P<0.01)，但作用不如AESN的20 μmol·L-1劑量組明顯。

2.6 AESN對MAPK信號通路的調節作用免疫熒光結果(Fig 6)顯示，給予1 mg·L-1LPS刺激45 min時，p-p38和p-ERK1/2核轉位明顯增加(P<0.01)，AESN在0.16～20 μmol·L-1對p-p38、p-ERK1/2核轉位具有明顯地抑制作用(P<0.01)，呈現劑量依賴性；陽性藥吲哚美辛(10 μmol·L-1)對p-p38、p-ERK1/2的核轉位也具有抑制作用(P<0.01)，作用不如AESN的20 μmol·L-1劑量組明顯。

2.7 AESN對COX-1、COX-2活性的影響由Tab 2可見，七葉內酯在4～100 μmol·L-1濃度范圍內呈劑量依賴性地抑制COX-1酶活性，對COX-1半數抑制濃度IC50為28.1 μmol·L-1。由Tab 3可見，七葉內酯在0.8～20 μmol·L-1濃度范圍內可呈劑量依賴性地抑制COX-2酶活性，對COX-2的半數抑制濃度IC50為2.3 μmol·L-1。

Tab 2 Effect of AESN on activity of

Tab 3 Effect of AESN on activity of

3 討論

炎癥反應是一種復雜的防御反應[6]，由多種細胞因子參與，適度的炎癥有利于機體健康，而過度的炎癥會引起不良反應，從而導致疾病甚至死亡[7]。在免疫反應發生過程中，巨噬細胞作為機體重要的免疫細胞和炎癥效應細胞，在誘導炎癥反應的過程中發揮關鍵作用[6-9]。脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分，具有抗原性，當革蘭氏陰性細菌崩裂時釋出，是很強的致熱原，近年來在動物和細胞實驗中被廣泛用來誘導炎癥的發生。LPS進入機體后，可以被巨噬細胞的TLR4識別并結合，啟動細胞內NF-κB、MAPK等信號通路，促使下游通路得到激發，導致多種炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、GM-CSF等以及炎癥介質NO、PGE2過量表達和分泌，引起機體損傷[10-14]。因此，抑制巨噬細胞分泌炎癥因子是緩解炎癥反應的重要環節。此外，LPS刺激巨噬細胞產生大量iNOS，iNOS與炎癥密切相關[10-11]，可誘導NO的產生，過量的NO將導致細胞損傷、組織壞死，進而促進炎癥性疾病發生發展，而且其產生能活化自身的環氧合酶COX，其中COX-2是誘生型表達的酶，與炎癥性疾病關系密切[13]。因此，本研究選用LPS誘導小鼠單核巨噬細胞白血病細胞RAW264.7急性炎癥模型探討七葉內酯的抗炎作用機制。

據報道[11-12]，目前已有許多中藥復方、單味中藥、中藥有效部位和有效成分均具有明顯的抗炎作用。本研究在確定天山堇菜七葉內酯對RAW 264.7細胞安全濃度范圍的基礎上，從細胞、基因、蛋白水平深入探討其對LPS誘導RAW264.7細胞炎癥反應的保護作用機制。本研究發現，天山堇菜七葉內酯可明顯降低LPS誘導RAW264.7細胞產生NO、TNF-α、IL-6、IL-1β水平，明顯降低TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS的mRNA表達水平，對iNOS的蛋白表達也具有明顯抑制作用，說明天山堇菜七葉內酯具有較好的抗炎作用，其抗炎作用與抑制炎癥細胞因子的生成密切相關。

COX是花生四烯酸代謝途徑中的關鍵酶，是體外抗炎藥物篩選的重要靶點之一[14-16]。COX有3種同工酶，即：COX-1、COX-2、COX-3[14]。COX-1為結構酶，主要起到內環境穩定作用。COX-2為誘導酶，正常生理狀態下，COX-2活性極低，在相關因素誘導后被激活，它可以誘導促進前列腺素等炎癥介質的合成，介導炎癥與疼痛反應，是炎癥發展過程中的關鍵酶之一[14-16]。本研究結果顯示，天山堇菜七葉內酯可顯著抑制環氧酶COX-1的活性，其IC50為28.1 μmol·L-1，同時可明顯抑制環氧酶COX-2的活性，其IC50為2.25 μmol·L-1。由于COX-2與COX-1的IC50比值為0.08，比值在0.01～0.1區間范圍內，則說明天山堇菜七葉內酯對COX-2抑制的選擇性較強，可作為COX-2的選擇性抑制劑，從而抑制炎癥的發生發展[15-16]，這也是七葉內酯發揮抗炎作用的主要機制之一。

NF-κB是炎癥反應中的關鍵轉錄因子。靜息狀態下與其抑制物IκBα形成無活性的復合體存在于細胞質中，當細胞受到LPS等刺激后其抑制物IκBα發生磷酸化降解，對NF-κB的抑制作用消失，NF-κB被激活，磷酸化后的NF-κB可轉至細胞核中促使下游基因轉錄，從而上調炎癥因子水平，加劇炎癥反應[17]。本研究結果顯示，LPS 刺激RAW 264.7細胞15 min后，IκBα蛋白明顯降解，LPS刺激30 min后，p-p65核轉位明顯增加，細胞核中p-p65蛋白高表達，這與LPS刺激24 h后，NO、TNF-α，IL-6，IL-1β等炎癥因子的高表達是相一致的。而天山堇菜七葉內酯對IκBα降解、p-p65核轉位具有明顯抑制作用，從而抑制下游炎癥相關基因的表達，表明天山堇菜七葉內酯發揮抗炎作用與抑制NF-κB信號通路密切相關。MAPKs信號通路也是經典的炎癥信號通路之一，主要由p38、ERK1/2和JNK 3條信號通路組成，是參與炎癥反應的主要組成部分[18]。當細胞受LPS刺激后，p38、ERK1/2和JNK蛋白被磷酸化，轉移入核調節多種轉錄因子，進一步促進炎癥因子的轉錄和翻譯，加劇炎癥反應的程度。本研究發現，LPS 刺激RAW 264.7細胞45 min后，p-p38和p-ERK1/2核轉位明顯增加，即p38、ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高，而天山堇菜七葉內酯對p-p38、p-ERK1/2核轉位具有明顯地抑制作用，蛋白磷酸化水平顯著下降，并呈現濃度依賴性，提示天山堇菜七葉內酯可通過抑制MAPKs信號通路，進而抑制炎癥的繼續發展。

綜上所述，天山堇菜七葉內酯具有較好的抗炎作用，其發揮抗炎作用的機制與抑制NF-κB/MAPK信號通路密切相關。