基于網絡藥理學和細胞實驗探討杜仲+續斷藥對治療骨質疏松癥的作用機制

張玉苗,劉 洋,劉艷平,李引剛,潘亞磊

[1.陜西中醫藥大學第一臨床醫學院，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學附屬醫院骨創傷一科，陜西 咸陽 712000；3.陜西中醫藥大學 陜西中藥資源產業化省部共建協同創新中心 秦藥特色資源研究開發國家重點實驗室(培育)，陜西 咸陽 712046]

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是以低骨量和骨組織的微結構退化，導致骨脆性增強、骨折風險增加為臨床特征的代謝性骨病。中醫將OP歸之于“骨痿”、“骨枯”等范疇，認為其發生、發展與“腎虛精虧”密切相關，以“補益肝腎”為主要治法。杜仲、續斷始載于《神農本草經》，具有堅筋骨、續筋骨的功效?！吨袊幍洹酚涊d杜仲、續斷的功能與主治均為“補肝腎、強筋骨”。在歷代醫家的驗方中，杜仲+續斷藥對配伍十分常見，如《千金要方》中的丹參丸，《本事方》中的思仙續斷丸，《扶壽精方》中的續斷丸等[1]。臨床上杜仲和續斷常相須為用治療OP，用藥頻率在常用方劑中分別位列第6和7位[2]。

杜仲、續斷治療OP的療效確切，但由于中藥多成分、多靶點的特點，兩藥做為相須藥對配伍治療OP的作用機制仍不明確。網絡藥理學可多層次、多角度分析中藥治療疾病的物質基礎及作用機制。本研究采用網絡藥理學及細胞分子實驗開展杜仲和續斷配伍治療OP機制研究，以期明確該藥對治療OP的作用機制，為相須藥對的研究及OP的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 杜仲+續斷藥對活性成分獲取于中藥系統藥理學分析平臺(https：//tcmspw.com/tcmsp.php，TCMSPM)、中藥分子機制生物信息學分析工具(http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/，BATAN-TCM)分別以OB≥30%，DL≥0.18以及Score cutoff≥20、AdjustP-value≤0.05為篩選標準檢索兩藥活性成分，并結合文獻報道補充桃葉珊瑚苷、川續斷皂苷VI等有效成分[3-4]。

1.2 構建“藥物-成分-靶點”網絡圖在Pharmmapper(http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)獲取活性成分潛在靶點。在GeneCards(https：//www.genecards.org/)、OMIM(https：//www.omim.org/)以“osteoporosis”為關鍵詞檢索疾病靶點。對比活性成分潛在靶點與疾病靶點，交集靶點為杜仲+續斷藥對活性成分治療OP的預測靶點，利用Cytoscap3.7.2呈現“藥物-成分-靶點”相互關系。

1.3 構建蛋白質-蛋白質相互作用網絡利用String(https：//string-db.org/)構建蛋白質-蛋白質相互作用關系網絡，并以Cytoscap3.7.2呈現靶點相互關系。

1.4 靶點通路分析及可視化在DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/)以P<0.05為篩選條件對關鍵靶點進行基因本體(gene ontolog，GO)生物學過程富集分析與基因組百科全書(KEGG)代謝通路富集分析，在微生信(http：//www.bioinformatics.com.cn)形成氣泡圖。

1.5 細胞分子實驗

1.5.1實驗動物、試藥與試劑 2日齡SPF 級SD 乳鼠6只，(220±10) g SD大鼠32只，雌雄各半，購自成都達碩實驗動物有限公司[生產許可證號：SCXK(川)2020-030]，飼養于陜西中醫藥大學SPF 級動物飼養室，SYXK(陜)2017-004；杜仲(20200102)、續斷(20200426)飲片購自陜西興盛德藥業有限責任公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、雙抗購自以色列BI公司；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、茜素紅購自美國Sigma公司；EdU成像檢測試劑盒(KGA331-100)購自江蘇凱基生物技術有限公司；ALP試劑盒(A059-1)購自南京建成生物工程研究所；BMP-2(1 ∶1 000，PA5-85956)和β-actin(1 ∶2 000，MA5-11869)抗體購自美國Invitrogen公司，Wnt、β-catenin、p-β-catenin、p38、RUNX2、兔二抗(1 ∶1 000，2721T、8480T、2009、8690T、12556S、7074)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.5.2主要儀器 細胞超凈操作臺( 蘇州安泰凈化有限公司)；311型CO2培養箱(美國Thermo公司)；IX73-DP73倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiskan GO 型全波長酶標儀(美國 Thermo 公司)；PAC300 型電泳儀、XRS+化學發光分析儀(美國 Bio-Rad 公司)。

1.5.3含藥血清制備 分別稱取杜仲300 g、續斷300 g、杜仲150 g+續斷150 g，加水淹沒中藥浸泡2 h；煎煮至水沸改用文火，30 min后過濾倒出藥液，重復共煎煮兩次，合并兩次濾液，旋轉蒸發儀減壓濃縮至200 mL，得生藥含量為1.5 kg·L-1水煎液。SD大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為空白組、杜仲組、續斷組、杜仲+續斷組，禁食12 h，以10 mL·kg-1灌胃體積給藥，空白組給予同等劑量的蒸餾水，每日1次，連續7 d。末次給藥1 h后，乙醚麻醉，腹主動脈采血，靜置30 min后，4 ℃離心，得空白血清和含藥血清，56 ℃水浴30 min滅活，微孔濾膜過濾，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5.4細胞增殖及堿性磷酸酶活性測定 酶消化法制備大鼠原代成骨細胞(osteoblast，OB)[5]，細胞接種于96孔板，密度為5×103個/孔，培養12 h后，設置空白組(CON，加入10%空白血清)、杜仲組(DZ，加入10%含杜仲血清)、續斷組(XD，加入10%含續斷血清)、杜仲+續斷組(DZ+XD，加入10%含杜仲+續斷血清)。加藥后繼續培養24 h，采用EdU標記法檢測細胞增殖，熒光顯微鏡拍照后用ImageJ統計。加藥后繼續培養至d 7，期間每2 d換液一次，測定堿性磷酸酶ALP活性。增殖或堿性磷酸酶表達率/%=(實驗組細胞OD值/空白組細胞OD值)×100%。

1.5.5OB礦化結節形成測定 細胞接種于24孔板，密度為1×105個/孔，培養12 h后，更換為分化培養基(含10%血清，0.1 μmmol·L-1地塞米松，50 mg·L-1抗壞血酸，10 mmol·L-1β-甘油磷酸鈉)，分組加藥同“1.5.4”，每3 d換液1次。細胞培養21 d后，茜素紅染色并在顯微鏡下拍照并用ImageJ統計分析礦化結節面積。

1.5.6Western blot檢測蛋白表達 細胞接種于6孔板，密度為5×105個/孔，培養12 h后，分組加藥同“1.5.4”，繼續培養48 h后，提取總蛋白，BCA法進行蛋白定量。蛋白變性后用12%分離膠進行電泳，用PVDF膜進行轉膜，封閉2 h，一抗孵育過夜，洗膜后加二抗室溫孵育1 h，洗膜后進行化學發光并拍照并分析。

2 結果

2.1 杜仲+續斷治療OP活性成分篩選通過TCMSP、BATMAN-TCM、PubChem檢索及文獻報道保留有效成分杜仲42個、續斷15個，共有成分2個，見Tab 1。

Tab 1 Active components in Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

NumberCompoundFormulaPubChem IDDZ31GenisteinC15H10O55280961DZ32DulcitolC6H14O611850DZ33Dimethylcaffeic acidC11H12O4717531DZ34CivetoneC17H30O5315941DZ35Cis-PinosylvinC14H12O25280457DZ36(2R,3R)-3-HydroxyprolineC5H9NO37098652DZ3711-Deoxyglycyrrhetic acidC30H48O312305517DZ387-HydroxycoumarinC9H6O35281426DZ39Gama-SitosterolC29H50O457801DZ40n-TriacontanolC30H62O68972DZ41GeniposideC17H24O10107848XD1GentisinC14H10O55281636XD2Isochlorogenic acid AC25H24O126474310XD3JaponineC18H17NO3442915XD4Sylvestroside IIIC27H36O14101967018XD5LoganinC17H26O1087691XD6Akebiasaponin DC47H76O1814284436XD7SwerosideC16H22O9161036XD8Lacceric acidC32H64O219255XD9CantleyosideC33H46O1912302406XD10SitoglusideC35H60O65742590XD11HelixinC41H66O1273296XD12Oleanolic acidC30H48O310494XD13Cauloside AC35H56O8441928XD14Isochlorogenic acid CC25H24O126474309XD15VenoterpineC9H11NO56842090AUrsolic acidC30H48O364945BBeta-SitosterolC29H50O222284CCC20H22O721582571

2.2 “藥物-成分-靶點”網絡圖及分析“藥物-成分-靶點”關系見Fig 1，圖中共185個節點，1 095個邊線，圓形節點為藥物，八邊形節點為活性化合物，菱形節點為80個靶點，其中20個黃色為杜仲靶點、7個藍色為續斷靶點，53個橙色為共同靶點，邊線代表化合物與靶點間聯系。

Fig 1 Medicines-compounds-targets network

2.3 靶點相互作用網絡及分析靶點相互關系見Fig 2，該圖有76個圓形節點、436條邊線，代表靶點之間的相互關聯，節點顏色深度、面積與其degree值成正比。杜仲+續斷藥對治療OP相關性排名前15位的靶點中的ALB、EGFR、MAPK1、MAPK8、CASP3、ESR1、HSP90AA1、AR、MAPK14、KDR、PGR共計11個為杜仲+續斷共同靶點，PLG、ANXA5、IGF1R共計3個為杜仲單獨作用靶點，SRC為續斷單獨作用靶點，提示該藥對治療OP具有協同增效作用。

Fig 2 The candidate targets interaction networkof Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

2.4 GO和KEGG通路富集結果與分析GO富集分析結果見Fig 3，結果顯示：杜仲+續斷主要作用于：細胞外泌體、細胞外間隙、細胞表面、受體復合物和核染色質等細胞組分；鋅離子結合、ATP結合、甾體激素受體活性、絲氨酸類內肽酶活性、序列特異性DNA結合等分子功能；以及轉錄作用、 DNA誘導型、負向調節RNA聚合酶II啟動子的轉錄、肽基絲氨酸磷酸化、轉錄的正調控、對蛋白激酶B信號傳導的正向調節等生物過程。KEGG通路富集分析見Fig 4。結合文獻研究，癌癥相關通路、破骨細胞分化、MAPK、Estrogen、FoxO、VEGF等信號通路與OP的治療具有相關性。

Fig 3 GO pathway enrichment analysis for cellular components,biological processes, molecular function of candidate targets of active components of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

Fig 4 KEGG pathway enrichment analysis of candidate targets of active components of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci

2.5 杜仲+續斷對OB增殖及堿性磷酸酶活性的影響如Fig 5所示，與空白組相比，杜仲組、續斷組和杜仲+續斷組的細胞增殖速率、堿性磷酸酶活性和礦化結節數量均提高，差異有顯著性(P<0.01)，且杜仲+續斷組增殖速率、堿性磷酸酶活性和礦化結節數量均明顯高于杜仲組或續斷組(P<0.01)。顯示杜仲續斷對OB增殖、分化和礦化具有協同增效作用。

Fig 5 Effect of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci on proliferation, differentiation and mineralization in

2.6 杜仲+續斷對OB BMP2和Wnt信號通路蛋白表達的影響與空白組相比，杜仲組、續斷組和杜仲+續斷組BMP2、p38、RUNX2、Wnt和β-catenin蛋白均明顯增加(P<0.05,P<0.01)；續斷組BMP2、p38和RUNX2蛋白明顯高于杜仲組(P<0.05或P<0.01)；杜仲組Wnt和β-catenin蛋白明顯高于續斷組(P<0.01)；杜仲+續斷組BMP2、p38、RUNX2、Wnt和β-catenin蛋白均明顯高于杜仲組和續斷組(P<0.01)；杜仲組和杜仲+續斷組與空白組相比p-β-catenin蛋白表達明顯減少(P<0.05或P<0.01)，見Fig 6。提示杜仲主要調節Wnt信號通路，續斷激活BMP2信號通路更明顯，杜仲續斷配伍具有協同增效作用。

Fig 6 Effect of Eucommiae ulmoides and Radix Dipsaci on protein expression of BMP2 and Wnt signaling pathway in

3 討論

杜仲和續斷作為補肝腎、強筋骨的常用中藥，常相須用于骨科疾病的臨床治療。既往研究表明杜仲+續斷藥對不僅可治療腰椎間盤突出癥[1]，還能促進骨折愈合提高骨密度[6]。中醫常將杜仲和續斷相須合用治療OP，既可補益肝腎以固本，又兼續筋骨、行血脈以預防骨質疏松性骨折，具有顯著的臨床療效。但該藥對治療OP的協同增效機制仍未探明。因此，本研究基于網絡藥理學和細胞分子實驗探究了杜仲+續斷治療OP協同增效的藥理學機制。

網絡藥理學研究結果顯示，杜仲+續斷治療OP的交集靶點共80個，核心靶點包括ALB、EGFR、MAPK1、MAPK8、CASP3、ESR1等。PPI及GO分析顯示這些靶點基因間具有很強的相互作用，并可通過調控細胞的增殖、分化、礦化、凋亡，參與鈣磷代謝等生物學進程，影響蛋白、酶、轉錄因子的結合等分子功能，這種多靶點、多途徑的作用機制體現了中醫藥治療疾病的整體觀。這些核心靶點基因可能通過以下機制影響OP的發生和發展：(1)調控細胞的增殖、分化、礦化：EGFR作為受體酪氨酸激酶超家族中的一員，能被生長因子家族成員結合、激活，并參與調節骨髓間充質干細胞、OB、破骨細胞、軟骨細胞等骨代謝相關細胞的增殖、分化過程[7]。MAPK家族不僅能促進骨髓間充質干細胞的成骨分化、提高OB活力、功能，還能阻斷RANKL介導的破骨細胞生成，進而防治OP的發生[8]，ESR1在OB中可通過CSE/H2S信號通路和骨骼中的雌激素信號傳導途徑來發揮成骨作用，并同ESR2在調控OB成熟礦化中起到調節平衡作用[9]。CASP作為傳統的與炎癥、細胞凋亡相關的蛋白酶，可以調節細胞的增殖和分化，CASP3缺陷小鼠的總骨密度、骨髓間充質干細胞成骨和增殖能力下降[10]；(2)參與鈣磷代謝：ALB被證明與鈣磷代謝紊亂具有顯著相關性，而OP的進展與鈣磷代謝是密切相關，研究發現激活Wnt/Ca2+信號通路可抑制骨髓間充質干細胞的自我更新，同時刺激OB分化[11]。

本研究對靶點基因進行了富集分析，以探尋杜仲+續斷治療OP時所調控的主要信號通路及其具體機制。結果顯示靶點蛋白涉及多條信號通路，主要包括癌癥相關通路、破骨細胞分化、MAPK、Estrogen、FoxO、VEGF等與骨代謝密切相關。(1)癌癥相關子通路眾多，大多與調控生長發育相關，其中，Wnt/β-catenin信號通路與OB、破骨細胞的生長分化以及骨髓間充質干細胞的成骨分化密切相關[12]。(2)MAPK信號通路主要包括ERK1/2、JNK、p38和ERK5等通路，既能作用于骨髓間充質干細胞、OB而促進成骨，還能阻斷破骨細胞的生成，對骨代謝進行雙重調節[8]。(3)Estrogen可通過促進破骨細胞凋亡和抑制OB產生破骨細胞分化因子而抑制骨吸收，還可促進局部骨血管生成從而改善骨質疏松[13]；(4)Foxo1通過調節OB增殖及氧化還原平衡控制骨形成，激活Foxo1通路可以調控骨髓間充質干細胞在OB和脂肪細胞之間的轉換[14]。(5)VEGF不僅能直接作用于OB，增加OB的堿性磷酸酶活性，促進其增殖分化及鈣結節的形成，亦能通過調節血管形成作用于骨髓間充質干細胞和破骨細胞參與骨代謝過程[15]。由此可見，杜仲+續斷治療OP可能是通過多途徑同時調控多條信號通路，主要圍繞促進骨形成、抑制骨吸收、改善細胞增殖環境、促進血管新生等方面來延緩OP的發生發展。

本研究選取癌癥相關的子信號通路Wnt/β-catenin和MAPK信號通路中的BMP2/p38/RUNX2途徑，進行細胞分子實驗以考察杜仲+續斷藥對的協同增效作用和機制。研究結果顯示杜仲+續斷促進OB增殖、堿性磷酸酶表達和礦化結節形成的能力明顯高于兩藥單獨作用，且杜仲主要調節Wnt信號通路，續斷則能夠更明顯的激活BMP2信號通路，兩藥配伍后對Wnt和BMP2通路調控作用顯著增強，這可能是杜仲+續斷治療OP的協同增效的作用機制。既往研究表明：杜仲及其有效成分可通過Wnt及p38等多條信號通路誘導骨髓間充質干細胞成骨分化[16]，續斷皂苷類成分也可通過BMP2/MAPK/RUNX2信號通路促進成骨細胞分化[17]，與本研究結果一致。

綜上所述，本研究從網絡藥理學角度對杜仲+續斷治療OP的潛在活性成分、關鍵基因和關鍵通路、機制進行了闡述，并通過細胞分子實驗證實了該藥對治療OP的協同增效作用。結果提示該藥對在OP的治療中可能涉及不同靶點和通路，通過促進成骨細胞的骨形成等相關骨代謝過程延緩OP的進展，體現了中醫藥治療OP多靶點、多途徑的治療特點。