艾納香中抗炎活性成分虛擬篩選及麥角甾醇過氧化物對NF-κB信號通路的影響

龍 利，彭俊超，楊 會，廖加美，蔡亞玲，王 魯

(貴州大學藥學院， 西南特色藥用生物資源開發利用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550025)

虛擬篩選技術由于其具有周期短、成本低、可操作性強、避免藥理實驗穩定性等特點，已成為篩選中藥活性成分最便捷的有效方法之一。趙宏等[1]利用分子對接技術發現，MAP2K1、MAPK1和PIK3CA等靶點可能為巴亞格七味散治療酒精性肝病的關鍵靶點。單佳鈴等[2]通過分子對接技術發現，荷包牡丹堿、柯伊利素、木犀草素可能為短穗兔耳草治療兩種疾病的有效化合物。

艾納香Blumeabalsamifera(L.)DC.為菊科艾納香屬植物，被譽為貴州優勢苗族藥物，是許多中成藥產品的原料藥，具有溫中活血、祛風除濕、緩解傷寒感冒、殺菌止癢、預防關節炎等功效[3]，近年來，其化學成分以及藥理學活性研究有了新的進展，目前文獻報道及數據庫搜索得到176種化學成分，包括萜類、黃酮類化合物、醇類和甾類等[4]。研究表明，艾納香中黃酮類、甾體類等有較好的抗炎活性，艾納香中活性成分芳樟醇抑制炎性因子的表達，抑制NF-κB信號通路激活[5]。我們前期研究發現，艾納香油能抑制炎癥慢反應物質產生，抑制TLR4信號途徑中相關蛋白以及COX-2的激活，減少TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、LTB4、PGE2的生成及iNOS的活性。為了探明艾納香中是哪些成分通過抑制TLR4信號活化來發揮抗炎作用，以及如何靶向TLR4信號通路上的關鍵蛋白。為此，我們以TLR4信號通路上的關鍵蛋白為靶點，運用分子對接技術虛擬篩選艾納香中抗炎活性成分，并通過檢測其對相關蛋白表達的影響探明其抗炎作用及機制。

1 材料與方法

1.1 生物信息平臺與軟件PDB數據庫(http://www.rcsb.org)、中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP)(https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中科院化學成分數據庫(http://www.organchem.csdb.cn)、 Chem3D 15.0軟件、AutoDock vina軟件。

1.2 細胞與試劑RAW264.7細胞購于昆明細胞庫，Hela細胞株由貴州醫科大學肖潮達副教授惠贈。DMEM高糖培養基、胎牛血清、胰蛋白酶均購于美國Gibco公司，脂多糖(血清型O1 1：B4)購于美國Sigma-Aldrich公司，IL-1β、IL-6細胞因子檢測試劑盒購自基因美公司，抗體NF-κB p65、p-NF-κB、IκBα、p-IκBα、β-actin、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗均購自Immunoway公司，DAPI細胞核染料購自Solarbio公司，麥角甾醇過氧化物(ergosterol peroxide,EP)購自西力生物技術有限公司(分子量為428.7)。

1.3 儀器Multiscan GO多功能酶標儀(Thermo Scientific公司)、UVP Touch System化學發光成像系統(德國耶拿Analytik jena)、Mini-PROTEAN Tetra凝膠電泳(美國Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1艾納香化學成分分子庫的構建及3D結構的獲取及格式轉換 通過中科院化學成分數據庫、TCMSP以及國內外文獻調研收集艾納香中化學成分，采用Chem Office 2015程序中的Chem Draw模塊繪制艾納香中化學成分的2D結構同時轉換為3D結構，并保存為mol2格式。最后，運用Discovery Studio軟件對艾納香化學成分進行能量最小化處理并轉化為pdbqt格式。

1.4.2TLR4信號通路關鍵蛋白晶體結構的獲取及格式轉換 TLR4信號通路中關鍵蛋白TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ的晶體結構從PDB獲取，并獲取各個蛋白的功能結構域如TLR4/MD-2的疏水口袋、MyD88的Toll/白介素1受體域(TIR)、IRAK的激酶結構域(KD)、TRAF6的鋅指結構域(TANK)、IKKβ的激酶結構域(KD)，使用Auto Dock Tools、Discovery Studio軟件對TLR4通路各個關鍵蛋白或結構域去水加氫處理以及能量最小化，并保存為pdbqt格式。

1.4.3虛擬篩選艾納香中抗炎活性成分 以TLR4信號通路的關鍵蛋白的功能結構域為包裹區域，設置其Grid box，采用Autodock Vina分子對接軟件進行虛擬篩選，以每個化合物與相關蛋白的結構域的最優結合能(affinity)打分進行排序，篩選出每個關鍵靶點排名前10的化合物，并對其進行加權處理(y=TLR4/MD-2×40%+MyD88×10%+IRAK×10%+TRAF6×10%+IKKβ×30%)，篩選出最優化合物，對最優化合物與TLR4信號通路各個靶蛋白通過Discovery Studio軟件進行可視化分析。

1.4.4MTT法檢測RAW264.7的細胞活性 體外培養RAW264.7細胞，選擇5×108·L-1濃度的細胞懸液加入96孔板，100 μL/孔，培養12 h后，分別設立0、1.2×10-5、2.3×10-5、4.7×10-5、9.3×10-5、1.9×10-4、3.7×10-4mol·L-1終濃度劑量的EP實驗組，同時設立空白組、LPS組、各劑量+LPS實驗組以及調零組，各個劑量重復4個孔，加藥混勻后培養24 h，取20 μL MTT培養4 h后棄去上清，加150 μL DMSO避光振搖10 min，在490 nm處測量其OD值。

1.4.5ELISA法檢測RAW264.7細胞因子的分泌 選擇5×108·L-1濃度的細胞懸液加入24孔板，500 μL/孔，培養12 h后，分別設立空白組、LPS組、各劑量EP+LPS組、EP陰性對照組，每組3個復孔。培養12 h后，收集細胞上清，按照ELISA說明書進行操作，450 nm處檢測吸光度，參照標準曲線計算IL-6、IL-1β含量。

1.4.6Western blot法檢測RAW264.7細胞NF-κB相關蛋白的表達 選擇1×109·L-1細胞密度加入6孔板，2 mL/孔，培養12 h后，按照1.4.4方法進行藥物干預設置分組，培養12 h后，倒掉細胞上清，參考方法操作并計算IκB、p-IκB、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白的灰度值，以β-actin為內參，計算各個目的蛋白相對表達量。

1.4.7激光共聚焦法檢測Hela細胞NF-κB p65的核移位 以3×108·L-1的Hela細胞鋪板于預先放入蓋玻片的6孔板中，24 h后，按照轉染試劑說明書，將偶聯上綠色熒光NF-κB p65(pEGFP-N1-p65)質粒在無血清的培養基條件下瞬時轉染入細胞(脂質體 ∶質粒DNA=10 μL ∶1 μg)，轉染4 h后，更換帶有血清的培養基轉染12 h后，分別設立空白組、LPS組、EP+LPS組分別繼續培養12 h，激光共聚焦顯微鏡在488 nm和507 nm處觀察偶聯熒光NF-κB p65的入核情況。

2 結果

2.1 艾納香的化學成分和TLR4關鍵靶蛋白文獻檢索和數據庫查詢共獲取艾納香中活性成分176個，主要包括萜類77個、黃酮類37個、甾體類3個、香豆素類3個以及其它。PDB獲取TLR4信號通路關鍵蛋白，其功能結構域信息見Tab 1。

Tab 1 The key proteins and functional domains of TLR4 signaling pathway

2.2 分子對接綜合打分結果將艾納香中176種活性成分與TLR4信號通路關鍵蛋白進行分子對接，Tab 2為篩選出綜合打分排名前10的化合物。

Tab 2 Weighted average results of molecular docking scores

2.3 EP與TLR4信號通路靶蛋白可視化分析EP結構式如Fig 1所示[5]，以3.2中打分最高的EP與靶蛋白的對接情況進行可視化分析，結果如Fig 2所示，EP與靶蛋白TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ之間存在氫鍵、范德華力、烷基以及π-烷基疏水作用等相互作用力。EP的過氧環主要與GLUB350、GLYA470、ASNA466 等氨基酸形成氫鍵。在結合空腔外圍，一些疏水氨基酸如VALD48、ARGB324、PROA468、GLUA442、LYSD125在保持口袋的疏水性起到了重要的作用。這表明EP與靶蛋白通過多種價鍵相結合，具有良好的結合穩定性。

Fig 1 Structural formula of EP

Fig 2 Visual analysis of target proteins in EP and TLR4 signaling pathwaysA：TLR4/MD-2 B：IRAK1 C：MyD88 D：TRAF6 E：IKKβ

2.4 EP對RAW264.7細胞活性的結果在有或無LPS(0.8 mg·L-1)影響下，EP(3.7×10-4mol·L-1)的細胞OD值與空白組相比差異無顯著性(P>0.05)，見Fig 3A、Fig 3B。這說明在24 h內EP在3.7×10-4mol·L-1濃度范圍內無論有無LPS存在下對RAW264.7細胞的活性無明顯影響。

Fig 3 Effect of EP on cell activity in presence or absence of LPS A: Effect of EP on cell activity B: Effect of EP+LPS on cell activity

2.5 EP對LPS致RAW264.7細胞因子分泌的結果細胞因子IL-6、IL-1β的分泌是評價細胞炎性反應的主要標志物，結果如Fig 4所示，與空白組相比，LPS刺激下RAW264.7細胞分泌的IL-6、IL-1β明顯升高(P<0.01)；與LPS組相比，不同濃度的EP可以明顯降低IL-6、IL-1β的分泌(P<0.01)，且呈劑量依賴性。

Fig 4 Effect of EP on secretion of IL-6 and IL-1β by LPS induced cells

2.6 EP對LPS致細胞IκBα、NF-κB p65蛋白表達的結果在TLR4/NF-κB信號通路中，IκB蛋白與NF-κB解離能促使NF-κB的主要亞基p65轉移至核內使NF-κB與下游靶基因結合從而導致炎癥因子的產生。本實驗檢測了IκBα、NF-κB p65的表達及其磷酸化水平。如Fig 5B所示，與空白組相比，LPS能明顯增強IκBα、NF-κB p65磷酸化水平(P<0.01)以及降低抗炎蛋白IκBα的表達水平；與LPS組相比，EP能明顯降低IκBα、NF-κB p65磷酸化水平，抑制IκBα的降解(P<0.01)。

Fig 5 Effect of EP on expression of inflammatory proteins of LPS induced NF-κB signaling pathway

2.7 EP對LPS致Hela細胞NF-κB p65蛋白亞細胞結構定位的結果為了明確EP對LPS處理后的NF-κB p65蛋白在Hela細胞的亞細胞定位，激光共聚焦顯微鏡記錄p65的入核情況。如Fig 6所示，與空白組相比，LPS刺激后綠色熒光明顯增強，這表明LPS會引起p65向細胞核轉移，而EP(4.7×10-5mol·L-1)處理后可以減弱p65核轉移。

Fig 6 Effect of EP on subcellular localization of NF-κB p65 protein

3 討論

TLR在炎癥、免疫細胞調控、存活和增殖方面發揮著關鍵作用，TLR和白細胞介素-1受體超家族共享一個TIR結構域[6]，TLR的信號傳導途徑被含有TIR 結構域的銜接蛋白調控，如MyD88、MAL、TRIF和TRAM、TIRAP，與不同的下游銜接蛋白的相互作用，使得各種TLR介導的信號傳導途徑具有特異性[7]。其中TLR4信號通路是TLR4與MD-2共同識別LPS后，胞內招募下游的接頭蛋白[8]，若募集的是MyD88即為MyD88依賴途徑，進而激活 IRAK、TRAF6、IKKβ以及NF-κB等，導致NF-κB磷酸化水平增加以及NF-κB核移位，活化的NF-κB進入細胞核后，其κB位點與下游的靶基因特定區域相結合進而引起一系列基因表達的增加[9]，引起細胞因子釋放，最終導致炎癥的發生。為此，本論文在前期研究發現貴州優勢苗族藥物艾納香的揮發油具有良好抗炎活性的基礎上，選擇了TLR4信號通路中的TLR4/MD-2、MyD88、IRAK1、TRAF6、IKKβ蛋白為靶向蛋白，采用分子對接技術虛擬篩選艾納香目前已報道的化合物，通過這一虛擬篩選技術，初步分析艾納香的抗炎活性成分。我們的實驗結果說明，分子對接打分前10的化合物如：EP、胡蘿卜甾醇、β-谷甾醇、16-貝殼杉烯、r-杜松萜烯、芫花素、艾納香素、木犀草素、Davidioside、金絲桃苷可能是艾納香的抗炎活性成分。

EP是一種天然類固醇，最早于1947年從曲霉屬中分離出來，存在于多種真菌中，具有抗氧化、抗炎、抗癌和抗病毒活性[10]。關于EP的抗炎活性研究也有報道，Liaw等[11]研究發現，EP對LPS刺激的巨噬細胞產生NO、TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2均有較好的抑制作用，并抑制NF-κB和C/EBPβ的轉錄活性以及MAPKs的磷酸化[12]，Tewtrakul等[13]發現EP抑制NO、PGE2和TNF-α釋放，并且下調iNOS和COX-2的mRNA表達量。從穿心蓮分離得到EP顯著降低TNF-α、IL-6和LPS/IFN-γ刺激的RAW264.7細胞分泌NO[14]。雖然已有文獻報道EP能夠抑制細胞因子的分泌以及NF-κB的活化，但EP如何抑制NF-κB的活化卻未做深入的研究。為了驗證分子對接的結果，并探討其作用機制，我們選擇了EP進行實驗研究。我們的結果證實EP抑制LPS介導的NF-κB的活化是抑制了NF-κB上游的IκB蛋白的降解和磷酸化以及NF-κB自身的磷酸化，抑制NF-κB亞基p65的核移位，最終導致細胞因子IL-6、IL-1β分泌的減少而發揮抗炎作用，且抑制NF-κB的活化也與上游蛋白IKKβ、IRAK1、MyD88以及TLR4/MD-2有一定的關聯性，分子對接的結果也佐證了EP與TLR4/MD-2、MyD88、IKKβ、IRAK1等蛋白有較強的結合力。這些結果補充了EP抑制NF-κB的作用機制，也為下一步深入研究和開發EP及含有EP的艾納香和其他相關中草藥提供了實驗數據。

我們推測EP有可能以TLR4/MD-2為直接作用靶點。分子對接的結果顯示EP能嵌入到TLR4與MD-2形成的疏水口袋中，并且EP與TLR4/MD-2的氨基酸殘基存在范德華力作用，也與TLR4/MD-2的氨基酸殘基存在疏水相互作用，這有可能是EP占據了LPS的空間，從而阻斷了LPS所導致的炎癥反應。同時，TLR4/MD-2在LPS-TLR4信號通路中扮演著不可或缺的角色，TLR4信號通路的活化需要LPS的傳遞、TLR4與MD-2的二聚化、MyD88或TRIF的銜接、IRAK1的磷酸化、IKKβ的激活以及NF-κB的入核促進大量細胞因子IL-6、IL-1β等的產生，引起“細胞因子”風暴，最終導致炎性疾病的產生。已有大量文獻報道了TLR4或MD-2的靶向抑制劑，通過破壞TLR4/MD-2異源二聚和TLR4同源二聚而阻止TLR4被激活，從而阻斷NF-κB/MAPK信號通路的激活[15]，以及上調p-p65和TLR4/MD-2復合物的表達，顯著抑制了NF-κB p65核轉入[16]。這說明TLR4/MD-2在炎癥中起著關鍵性作用，因此EP有可能以TLR4/MD-2為靶點，從源頭上阻止LPS的信號轉導。當然，EP是否是通過TLR4/MD-2與蛋白結合從而影響IκBa和NF-κB p65的磷酸化，則需要進一步探究。