甲酰肽受體激活劑丹皮酚抑制類風濕關節炎的作用

楊小四，邵玉寶，李文昊，龔澤睿，陳萌檬，王家昊，盛書顏，陳曉宇

(1.安慶醫藥高等專科學校基礎醫學院， 安徽 安慶 246052；2.安徽醫科大學形態學實驗中心，3.安徽醫科大學臨床醫學院 安徽 合肥 230032；4 .皖南醫學院藥學院， 安徽 蕪湖 241003)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種伴有全身性免疫失調和自身免疫的滑膜疾病，臨床主要表現是滑膜炎癥和關節損傷，由多種因素共同作用引起，包括遺傳因素和環境因素[1]。在RA中，成纖維樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocyte，FLS)具有獨特的侵襲行為，在疾病的發病機理和進展中作用明顯，FLS已經成為RA發病機理研究的重要貢獻者[2]。此外，巨噬細胞參與破壞性的破骨細胞形成過程，是RA組織中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的關鍵來源[3]。因此，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導RAW264.7的巨噬細胞模型經常被用來探索RA發病機理[4]。

丹皮酚在現代中國的臨床應用有很長的歷史。研究表明，丹皮酚具有廣泛的抗炎活性，能夠降低炎癥細胞因子(IL-1β和IL-6)水平，通過抑制NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3)信號通路減輕炎癥反應[5]。在RA患者中，心血管疾病嚴重程度與RA疾病活動的關系較傳統心血管風險因素的關系更為密切[6]。丹皮酚同時具有心臟保護作用，作為RA治療或輔助治療藥物具有巨大的潛力[7]。可見丹皮酚具有良好的應用前景，但目前對丹皮酚的藥理作用缺乏整體的評估。

生物信息學作為現代科學技術發展的產物，能夠更加深入全面的了解各種生物過程[8]。本研究選取LPS刺激的RAW264.7細胞炎癥模型相關GEO數據，通過分析LPS刺激前后及丹皮酚處理前后的差異基因進行分析，對丹皮酚潛在的藥理作用進行全面的分析，并對其中最具有潛力的藥理作用進行進一步的實驗驗證。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑人類風濕關節炎FLS購買于上海冠道生物工程有限公司；RAW264.7細胞購買于中國科學院細胞庫；TRIzol(15596026)購買于InvitrogenTM；逆轉錄試劑盒PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(6210A)購買于TaKaRa公司；實時熒光定量試劑盒Applied BiosystemsTMSYBRTMGreen(4385610)購買于Thermo Fisher公司；胎牛血清(fetal bovine serum，S711-00sS，Lonsera)；雙抗(penicillin-streptomycin solution，SV30010，Hyclone)；RPMI 1640培養基(RPMI 1640 medium，SH30027.01，HyClone)

1.2 儀器熒光定量儀PCR-ABI(賽默飛世爾科技，美國)；FLIPR Tetra?高通量CCD熒光成像分析系統(美谷分子儀器，上海)；GraphPad Prism 7.00數據處理軟件。

1.3 方法

1.3.1數據收集 從高通量基因表達數據庫(gene expression omnibus，GEO)中獲取關于LPS誘導RAW264.7細胞的模型相關數據：GSE86588數據集(GPL1261 [Mouse430_2] Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 Array)，GSE21841數據集(GPL18802 [MoGene-2_0-st] Affymetrix Mouse Gene 2.0 ST Array)，GSE76563數據集(GPL10787 Agilent-028005 SurePrint G3 Mouse GE 8x60K Microarray (Probe Name version))，GSE9632(GPL2995 ABI Mouse Genome Survey Microarray)。根據各的注釋平臺，去除映射多個基因的探針和空探針。如果有許多個探針匹配到相同的基因符號，則將其平均值視為基因表現值。

1.3.2聯合分析差異基因 分別提取LPS處理組與對照組數據進行聯合分析，首先使用R包“affy”對數據GSE86588、GSE21841和GSE76563進行校準，再根據每組數據的測序平臺分別注釋，GSE86588使用GPL10787注釋文件進行注釋，GSE21841使用GPL1261注釋文件，GSE76563使用GPL18802注釋文件[9]。合并注釋后的文件，并使用R包“sva”去除批次效應[10]。3組數據分別按照陰性和陽性特點分進行分組合并，將3組數據集中RAW264.7未處理組與LPS處理組分別合并，分組信息見 Tab 1。使用R包“limma”對合并后的表達矩陣進行差異分析，得到差異基因169個，其中上調基因160個，下調基因9個，篩選條件為log Fold Change=1.5，adjustP=0.05。

Tab 1 GEO data list rearrange

1.3.3基因功能富集 使用R語言對差異基因進行基因本體論(gene ontology，GO)功能富集和《京都議定書基因與基因組百科全書》(the kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)相關途徑分析，并對結果進行可視化。

1.3.4細胞培養 細胞系RAW264.7使用RPMI 1640培養基，RA-FLS培養在DMEM培養基，均添加10%胎牛血清、1%雙抗，在含有5% CO2，環境溫度為37 ℃的培養箱中進行培養。

1.3.5實時熒光定量PCR 使用TRIzol Reagent (15596026，InvitrogenTM)從細胞中提取總RNA，使用BeyoRTTMⅢ cDNA合成試劑盒(with gDNA EZeraser，D7180S)將mRNA反向轉錄成cDNA，使用BeyoFastTMSYBR Green One-Step qRT-PCR Kit (D7268S，beyotime)試劑盒進行檢測。參數設置：95 ℃ 15 s，95 ℃ 5 min，60 ℃ 1 min，30個循環，使用CFX96 Touch熒光定量PCR檢測系統(Bio-Rad)進行檢測。在反應結束時，進行熔融曲線分析，以檢查引物-二聚體的存在。數據用2-ΔΔCT法計算相對表達量，所有的樣本都以3個復孔處理，并至少進行3個獨立的實驗。引物通過Primer 6.0軟件設計，并用BLAST分析每條引物的特異性，引物序列見Tab 2。

1.3.6細胞劃痕 使用鉛筆在12孔板底部劃一條水平線，后將RA-FLS細胞鋪于12孔板中，待細胞密度達到50%使用TNF-α刺激細胞，12 h后更換新鮮培養基，使用不同濃度的丹皮酚進行處理，以DMSO為對照，繼續培養48 h。用槍頭在12孔板中垂直畫線，隨后用磷酸鹽溶液(PBS)洗去漂浮細胞，于顯微鏡下拍照。將細胞放在培養箱中繼續培養6 h，再次拍照，比較不同處理方式中細胞的遷移效率。

1.3.7鈣離子濃度檢測 將FLS細胞與鈣離子染色劑共同孵育30 min，洗去染色劑，向細胞中加入不同濃度的丹皮酚及抑制劑 Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-NH2(WRW4)，在FLIPR Tetra?儀器中檢測熒光強度。設置檢測間隔為10 s，持續檢測30 min。

2 結果

2.1 LPS誘導模型中差異基因的篩選生物信息學在探索藥物機制方面凸顯出了強大的能力，在轉錄層面分析藥物對基因表達的影響，利用基因的變化水平及相互關系分析，為研究藥物提供線索。利用R語言對3組巨噬細胞相關測序數據集進行聯合分析，首先根據是否經過LPS處理分為兩組，分組信息見Tab 1。利用差異基因分析，并繪制差異基因繪制火山圖(Fig 1A)和熱圖(Fig 1B)，其中有9個表達下調基因，160個上調基因。選擇其中上調的6個基因進行實時熒光定量PCR實驗驗證，在mRNA表達水平使用RT-qPCR實驗對其中部分基因進行表達驗證，RAW264.7細胞經LPS誘導6 h后與未經誘導的NC組進行mRNA表達水平的檢測Edn1、Ccrl2、Cmpk2、Saa3、Cxcl2、Cxcl11均被上調(Fig 1C)。驗證結果表明，LPS誘導模型特征與生物信息學分析結果相符。這些基因分別代表了不同的聚類子集。

Fig 1 Differentially expressed genes (DEGS) analysis of RAW264.7 cells induced by LPS

2.2 差異基因功能富集分析通過對169個基因進行功能富集，包括GO(gene ontology,GO)，生物學過程(biological process，BP)，細胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)。分析結果表明169個DEGs與生物學過程、細胞微環境、分子功能與炎癥水平密切相關(Fig 2A)。先天免疫反應、細胞外空間、細胞因子活性。KEGG基因功能分析結果表明162個DEGs主要集中在炎癥相關通路(如TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway)，表明這些差異基因主要與細胞炎癥水平密切相關(Fig 2B)。

Fig 2 GO functional enrichment

2.3 丹皮酚的基因影響分析使用GEO2R分析數據集GEO9632，分析丹皮酚對LPS誘導的RAW264.7細胞的影響，結果表明，有275個基因受到丹皮酚影響，其中147個上調，128個下調。對此275個DEGs繪制火山圖(Fig 3A)，并進行了KEGG富集分析(Fig 3C)。根據KEGG分析顯示，丹皮酚主要影響生物過程“Amacrine cell differentiation”和細胞成分“Plasma membrane”。

Fig 3 DEGs analysis about RAW264.7 cells treated with paeonol or not

對丹皮酚調控的基因進行進一步的分析，通過對受丹皮酚影響的275個基因與169個受LPS調控的炎癥相關基因進行Venn圖繪制(Fig 3B)。得到了3個同時受LPS和丹皮酚共同調控的基因，甲酰酞受體(formyl peptide receptor,FPR)、Cd83與Cfb可能與丹皮酚的作用機制相關。這里我們主要分析了甲酰肽受體FPR，FPR主要分布于人體免疫細胞，調控多種重要生理功能，廣泛參與各類炎癥疾病的發生和發展[11]。

2.4 丹皮酚通過FPRL1抑制FLS發展通過細胞劃痕實驗，觀察FPRL1在細胞遷移中的影響。通過RT-PCR檢測FLS不同處理組炎癥因子mRNA水平，以評價丹皮酚對炎癥因子的抑制能力。結果表明，丹皮酚能夠抑制TNF-α誘導的FLS遷移，同時FPRL1抑制劑WRW4能夠拮抗丹皮酚對FLS遷移的抑制作用(Fig 4A)。經過TNF-α誘導后，炎癥因子水平明顯升高，在丹皮酚處理6 h后降低。在使用了FPR選擇性抑制劑WRW4后，丹皮酚的抑制炎癥能力被明顯抑制，提示丹皮酚的抗炎作用一定程度上依賴FPR的激活(Fig 4C)。綜上所述，丹皮酚能夠抑制FLS細胞的炎癥反應，且FPRL1在其中起到重要作用。

Fig 4 Paeonol has anti-inflammatory effect in FLS

2.5 丹皮酚影響FPR的激活FPR配體可能是一種能夠改善RA炎癥和骨骼損傷的新型治療藥物。為了進一步證明丹皮酚可以作為FPR的配體，激活FPR受體功能，研究了丹皮酚對細胞內鈣離子濃度的影響(Fig 5)。丹皮酚在10 μmol·L-1濃度下能夠明顯提高細胞內鈣離子的濃度，且這種能力被抑制劑WRW4所限制。

Fig 5 Paeonol affected calcium influx in FLS through FPRL1 Determination of calcium ion concentration in FLS cells treated with paeonol and WRW4.

3 討論

丹皮酚具有廣泛的抗炎作用，在RA中有多種機制，但是缺乏其對RA的系統研究[12]。本研究通過LPS-RAW264.7模型進行差異基因篩選，該模型在許多炎癥疾病表型中具有代表性[4]。分析獲得160個上調，9個下調基因，根據基因分枝樹圖不同，各分枝內隨機選取一個基因，共計6個基因(Edn1、Ccrl2、Cmpk2、Saa3、Cxcl2、Cxcl11)進行mRNA表達水平檢測，取得結果與生物信息學分析結果趨勢一致。

為了分析這些基因在細胞中承擔的功能，對差異基因進行GO和KEGG分析，GO分析結果主要為Innate immune response，Defense response to virus等機體免疫功能，KEGG分析主要與TNF signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway等與炎癥通路相關，與先前的報道一致，為后續丹皮酚藥理分析奠定了基礎。

接下來研究丹皮酚對該模型中基因及細胞功能的影響。通過對LPS-RAW264.7模型在丹皮酚處理前后進行分析，得到275個差異基因，并對其進行KEGG分析。結果顯示，丹皮酚主要影響生物過程“Amacrine cell differentiation”和細胞成分“Plasma membrane”。由此推斷，丹皮酚對LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥抑制可能通過細胞膜相關功能而產生。

綜合以上兩部分差異基因，對其進行Venn分析，結果提示FPR、Cd83與Cfb為丹皮酚作用機制的核心基因。根據丹皮酚KEGG分析結果，其主要影響細胞膜相關功能，遂將研究重點聚焦在FPR蛋白。

FPR屬于G蛋白偶聯受體超家族，在維持炎癥反應的平衡中有非常重要的作用[13]。眾多研究表明，FPRL1可能是一種能夠改善RA炎癥和骨損傷的新型治療藥物[14]。FPRL1的這種特性吸引了我們注意力，并對其進行更深入的研究，我們推測丹皮酚可能通過FPR產生對關節炎的抑制作用。目前已有FPR激活劑被證明可以抑制RA的發展，抗菌肽Scolopendrasin IX可以通過激活FPRL1產生對RA的治療作用[15]；FPR激動劑Cpd43在RA小鼠模型中減少破骨細胞形成和炎癥，并在相關的人類細胞中顯示抗炎作用[14]。FPRL1對關節炎的抑制作用可以被抑制劑WRW4(Trp-Arg-Trp-Trp-Trp-Trp-NH2)減弱[16]。

本研究中，丹皮酚對FLS細胞的炎癥抑制作用能夠被WRW4所阻礙，在WRW4的作用下，丹皮酚對TNF-α誘導FLS細胞中IL-6、TNF-α與IL-1β的水平的抑制作用有所減弱(Fig 4 C)。丹皮酚對LPS誘導炎癥因子表達的能力依賴于FPR的激活，提示丹皮酚對關節炎的抑制作用可能在一定程度上依賴于FPR的激活。

研究表明，FPR激活后，促進鈣離子內流[17]。為了進一步了解丹皮酚是否能夠激活FPR，并引起炎癥抑制，對丹皮酚產生的鈣離子內流水平進行探究。如圖Fig 5所示，丹皮酚能夠增加鈣離子內流，且該作用被抑制劑WRW4所阻礙。因此，我們認為丹皮酚能夠促進鈣離子內流，但該研究仍有局限，尚不能確定是否為直接影響。

綜上，我們認為丹皮酚能夠通過FPR通路對RA產生抑制作用，但僅限于此，在今后的研究中需進一步的探索，確認丹皮酚是否直接影響FPR的激活。此外，本研究中利用了GEO數據庫內已經公開的測序數據，結合多個數據組進行綜合分析，充分挖掘已有的測序結果，對公共數據庫內的數據進行了充分的利用，并進行了優化與探索。