替米沙坦對(duì)大鼠胰島素分泌作用的影響及其機(jī)制研究

崔麗娟，楊歡歡，支淋萍，劉 濤，3

(山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.機(jī)能實(shí)驗(yàn)室、2.藥理教研室，山西 太原 030001，3.山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院普通外科，山西 太原 030032)

替米沙坦是經(jīng)典的血管緊張素受體阻斷劑，在臨床上廣泛用于高血壓病和心力衰竭的治療[1]。近年來，大量的文獻(xiàn)表明，替米沙坦可以使糖尿病病人獲益，機(jī)制包括保護(hù)胰島β細(xì)胞功能[2]，緩解周圍胰島素抵抗[3]，改善糖尿病腎病[4]，抑制高血糖的引起的心血管損害[5]，改善肥胖病人的能量代謝，維持瘦素的敏感性[6]，減輕高糖帶來的抑郁[7]等。2型糖尿病以胰島素分泌不足和胰島素抵抗為主要特征，其中胰島素分泌不足被認(rèn)為是決定糖尿病發(fā)生發(fā)展的重要因素。但是，目前替米沙坦可以調(diào)控胰島素分泌，直接影響胰島素的分泌卻鮮有報(bào)道。本研究旨在研究替米沙坦對(duì)胰島素分泌的影響，同時(shí)由于β細(xì)胞的胰島素分泌是電生理過程[8]，我們通過鈣成像及膜片鉗技術(shù)進(jìn)一步研究其相關(guān)的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 ♂Wistar大鼠，體質(zhì)量為(240～260)g，清潔級(jí)，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。生產(chǎn)許可證號(hào)：SYXK (晉)2019-0007。

1.1.2藥品及試劑 替米沙坦，美國MCE公司(批號(hào)144701-48-4)；膠原酶P(collagenase P)：瑞士Roche公司(批號(hào)11213865001)；Histopaque-1077：美國Sigma-Aldrich公司(RNBJ0578)；Fluo-2AM染料：日本同仁化學(xué)研究所(批號(hào)11213865001)；RPMI 1640培養(yǎng)基：上海生工(批號(hào)C518FA0002)；胎牛血清：上海生工(批號(hào)B326FA0092)。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 體式顯微鏡：上海中恒(型號(hào)SM262)；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS(型號(hào)AE-2000)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，德國Eppendorf(型號(hào)Galaxy 170)；電極拉制儀：日本Narishige(型號(hào)PB-830)；膜片鉗系統(tǒng)：德國HEKA(型號(hào)MP-285)；鈣成像系統(tǒng)：北方MDE公司(型號(hào)LAMBDA 10-B)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1大鼠胰島及胰島細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 斷頭處死大鼠后迅速打開腹腔，經(jīng)膽總管向胰管內(nèi)注入1 g·L-1的膠原酶P，將膨脹的胰腺完整剝離后置于37 ℃恒溫振蕩器中水浴消化11 min。培養(yǎng)液終止消化后加入Histopaque-1077分離液，梯度離心法分層制得大鼠胰島。在體式顯微鏡下挑取形態(tài)飽滿、大小適中的胰島。在含胰島的培養(yǎng)液中加入5 g·L-1DispaseⅡ溶液分離胰島制得胰島細(xì)胞。大鼠胰島和胰島細(xì)胞均在含10%胎牛血清和青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。方法參考實(shí)驗(yàn)室傳統(tǒng)成熟技術(shù)[9]。

1.2.2胰島素分泌實(shí)驗(yàn) 將分離出的胰島培養(yǎng)過夜后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆纸M，每組7管，每管放置挑選好的大小均等的胰島5個(gè)。首先各組胰島在含2.8 mmol·L-1葡萄糖的培養(yǎng)液中預(yù)孵育30 min，棄去上清液。再加入含不同葡萄糖濃度和藥物的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育30 min，取上清液采用放射免疫法測(cè)定胰島素含量。

1.2.3鈣成像實(shí)驗(yàn) 將分離好的胰島細(xì)胞置于載玻片上，在培養(yǎng)皿中用配好的含2.8 mmol·L-1葡萄糖和2 μmol·L-1Fura-2AM(鈣離子熒光指示劑)的培養(yǎng)液中避光孵育30 min，清洗去除多余的染液，避光轉(zhuǎn)移至含2.8 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)液的鈣離子成像系統(tǒng)的浴槽中。激發(fā)光波長分別設(shè)置為340 nm和380 nm，發(fā)射光波長設(shè)置為510 nm，熒光值F340/F380的改變即反映出細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化。分別用含不同濃度的葡萄糖和藥物的培養(yǎng)液干預(yù)細(xì)胞，觀察細(xì)胞內(nèi)熒光值比值隨時(shí)間的變化情況。

1.2.4膜片鉗實(shí)驗(yàn) 配置相應(yīng)離子通道的電極內(nèi)外液。電壓門控性鉀(Kv)通道電極內(nèi)液各成分濃度依次為(mmol·L-1)：NaCl 10，KCl 140，MgCl 1，EGTA 0.05，HEPES 10，Mg-ATP 0.3；外液為NaCl 138，KCl 5.6，MgCl21.2，CaCl22.6，HEPES 5。電壓門控性鈣通道(VGCC)的電極內(nèi)液：CsCl 120，MgCl21，EGTA 0.05，TEA 20，HEPES 10，CAMP 0.1，Mg-ATP 5；外液為CsCl，NaCl 100，BaCl220，MgCl21，TEA 20，HEPES 5。用電極拉制儀和拋光儀制備電極，電阻大小為5～8 MΩ，充灌相應(yīng)的電極內(nèi)液，高阻封接后破膜，改為全細(xì)胞模式，快電容補(bǔ)償。設(shè)置鉗制電壓為-70 mV，刺激步階為10 mV，Kv通道序貫給予-70 mV到+80 mV的電壓刺激，刺激時(shí)程為400 ms，VGCC則給予-50 mV到+30 mV的電壓刺激，刺激時(shí)程為50 ms，記錄時(shí)程內(nèi)的各通道的電流變化。

2 結(jié)果

2.1 替米沙坦對(duì)離體大鼠的胰島素分泌的影響如Tab 1所示：不同濃度的(10、50 μmol·L-1)的替米沙坦在低葡萄糖濃度(2.8 mmol·L-1)下對(duì)離體大鼠的胰島素分泌沒有影響，但在高葡萄糖濃度下(8.3 mmol·L-1)卻表現(xiàn)出藥物濃度依賴性的促胰島素分泌作用。進(jìn)一步我們?cè)诟叩钠咸烟菨舛?11.1和16.7 mmol·L-1)下，采用10 μmol·L-1的替米沙坦干預(yù)，Tab 2顯示隨葡糖糖濃度的升高，替米沙坦的促胰島素分泌作用逐漸增強(qiáng)。

Tab 1 Effect of telmisartan on insulin secretion

Tab 2 Insulin secretion glucose-dependently potentiated

2.2 替米沙坦對(duì)胰島β細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響分別在低(2.8 mmol·L-1)和高(16.7 mmol·L-1)葡萄糖濃度下鈣成像實(shí)驗(yàn)，F(xiàn)ig 1結(jié)果表明，在低糖濃度下濃度逐漸增高的替米沙坦并沒有提高胰島β細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，而作為陽性對(duì)照的Tolbutamide卻出現(xiàn)了明顯的Ca2+濃度升高。在高糖濃度替米沙坦可以升高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度，且隨著替米沙坦劑量的逐漸增大(10、50 μmol·L-1)，升鈣作用逐漸增強(qiáng)(Fig 2)。

Fig 1 Effect of telmisartan on intracellular Ca2+concentration ([Ca2+]i) in low glucose condition

Fig 2 Effect of telmisartan on intracellular Ca2+concentration([Ca2+]i)in high glucose condition

2.3 替米沙坦對(duì)胰島β細(xì)胞Kv通道的作用分別用不同劑量的替米沙坦行膜片鉗實(shí)驗(yàn)，比較Kv通道電流-電壓曲線中各組細(xì)胞在+80 mV時(shí)的電流密度。結(jié)果顯示：10 μmol·L-1和50 μmol·L-1替米沙坦對(duì)胰島β細(xì)胞的Kv通道具有明顯的抑制作用(見Tab 3)。

2.4 Kv通道不是替米沙坦發(fā)揮作用的唯一因素在高糖濃度(8.3 mmol·L-1)下，采用Kv通道的抑制劑TEA(20 mmol·L-1)行胰島素分泌實(shí)驗(yàn)，可以看出TEA明顯促進(jìn)了胰島素分泌(P<0.01)，但是，10 μmol·L-1的替米沙坦在TEA存在的情況下仍然可以明顯地促進(jìn)胰島素分泌(P<0.01)，這表明Kv通道不是替米沙坦促進(jìn)胰島素分泌的唯一因素(見Tab 4)。

Tab 4 Kv channels not alone involved in mediating telmisartan-induced insulin secretion(μIU·L-1)

2.5 替米沙坦對(duì)胰島β細(xì)胞VGCC的作用進(jìn)一步行VGCC的膜片鉗實(shí)驗(yàn)，觀察替米沙坦對(duì)其的作用。電流-電壓曲線中在0 mV時(shí)各組細(xì)胞的電流密度比較表明，隨著劑量的逐漸增加，替米沙坦顯示出逐漸增強(qiáng)的激活β細(xì)胞VGCC的作用(Tab 5)。

3 討論

糖尿病和高血壓是臨床上最為常見的兩種疾病，而且它們之間通過多種病理生理機(jī)制相互聯(lián)系，形成惡性循壞，導(dǎo)致較高的死亡率和發(fā)病率，嚴(yán)重威脅人類的健康。由于血管緊張素受體阻滯劑可以使糖尿病和糖尿病前期的患者獲益，因此被美國糖尿病協(xié)會(huì)等機(jī)構(gòu)推薦作為糖尿病合并有高血壓的病人降壓治療的一線藥物[10]。但目前尚未見到關(guān)于此類藥物對(duì)胰島素分泌作用影響的報(bào)道。即使有可見的有關(guān)替米沙坦促進(jìn)胰島素分泌的文獻(xiàn)，也僅僅是替米沙坦由于抑制高糖引起的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，進(jìn)而避免胰島β細(xì)胞功能失衡，抑制β細(xì)胞凋亡的長期保護(hù)作用的結(jié)果[2，11]。本次研究我們首次發(fā)現(xiàn)替米沙坦作為胰島素促泌劑，可以“急性”地促進(jìn)胰島素分泌。

本實(shí)驗(yàn)表明，替米沙坦不僅可以迅速地促進(jìn)胰島素的分泌，而且更為關(guān)鍵的是，這種促分泌作用是葡萄糖濃度依賴性的，即只在高糖濃度下發(fā)揮作用，低糖濃度下無促進(jìn)作用。這說明替米沙坦可以在促進(jìn)胰島素分泌的前提下最大可能地避免低血糖的發(fā)生。低血糖是目前糖尿病治療過程中最為常見也是最為嚴(yán)重的并發(fā)癥；不僅僅是因?yàn)橥ǔＫJ(rèn)識(shí)的“顯性”的低血糖可以引起昏迷和神志不清，影響日常生活，更為重要的是反復(fù)的“隱匿”的低血糖可以引起一些致死性的心臟并發(fā)癥，如心律失常、心肌缺血梗死，而且引起神經(jīng)認(rèn)知系統(tǒng)的損害，可能加劇中老年糖尿病人發(fā)生癡呆的風(fēng)險(xiǎn)[12]。所以，避免低血糖并發(fā)癥的發(fā)生，目前成為評(píng)價(jià)治療糖尿病藥物的一個(gè)重要指標(biāo)[13]。同時(shí)目前關(guān)于“胰島素的過分泌”的理論逐漸受到重視，很多文獻(xiàn)指出持續(xù)地促進(jìn)胰島素的分泌，具有潛在的加劇胰島β細(xì)胞功能惡化的趨勢(shì)，有可能加速2型糖尿病的進(jìn)程[14]。臨床報(bào)道也證實(shí)如甲苯磺丁脲一類的葡萄糖濃度非依賴性的胰島素促泌劑，確實(shí)存在比其它如格列本脲、二甲雙胍等抗糖尿病藥物整體長期療效差的不足[15]。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，替米沙坦可以在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候根據(jù)葡萄糖濃度的需要成比例地“智能化”促進(jìn)胰島素的分泌，這無疑可以最大程度地避免以上弊端。

細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在胰島β細(xì)胞分泌胰島素中發(fā)揮著重要作用，包括胰島素的合成、分泌[8]。我們進(jìn)一步研究了替米沙坦與胰島β細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的關(guān)系，與其促胰島素分泌作用一致，只有在高糖濃度下才可見明顯的升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，且隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度進(jìn)一步升高。β細(xì)胞分泌胰島素是一個(gè)電生理過程?？紤]到Kv通道在葡萄糖濃度依賴性地促進(jìn)胰島素分泌和提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度中起重要作用[16-18]，所以進(jìn)一步我們用膜片鉗技術(shù)探索替米沙坦對(duì)Kv通道的影響，結(jié)果表明替米沙坦確實(shí)抑制Kv通道的電流。高糖濃度下，葡萄糖代謝轉(zhuǎn)化為ATP濃度的升高，使得ATP/ADP 比例升高，這會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞的KATP通道關(guān)閉，引起細(xì)胞膜去極化。細(xì)胞的去極化會(huì)同時(shí)激活細(xì)胞的Kv通道和鈣通道，引起鉀離子外流和鈣離子內(nèi)流，這兩種電流相互對(duì)抗共同構(gòu)成了細(xì)胞的復(fù)極化階段[16，18]。抑制Kv通道影響分泌和鈣離子濃度的機(jī)制在于其可以延緩鉀離子外流，削弱對(duì)鈣離子內(nèi)流的對(duì)抗而延長復(fù)極化的時(shí)間，也就是鈣內(nèi)流的時(shí)間，因而提高了鈣離子濃度，促進(jìn)了胰島素的分泌。

TEA是Kv通道的抑制劑，文獻(xiàn)報(bào)道20 mmol·L-1的TEA可以抑制幾乎85%～90%的鉀電流，從而促進(jìn)胰島素分泌[17]。但我們的實(shí)驗(yàn)卻表明，即使在TEA顯著提高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，促進(jìn)胰島素分泌的基礎(chǔ)上，替米沙坦仍然可以繼續(xù)發(fā)揮作用，這表明Kv通道不是替米沙坦發(fā)揮作用的唯一因素。隨之的結(jié)果也表明了這一點(diǎn)，替米沙坦還可以激活VGCC。正是因?yàn)殁浲ǖ篮外}通道的激活均必須在高糖狀態(tài)下關(guān)閉KATP通道引起細(xì)胞去極化的前提下，所以替米沙坦的電生理特征，即抑制Kv通道延長鈣內(nèi)流的時(shí)間，激活鈣通道促進(jìn)鈣內(nèi)流，決定了替米沙坦促進(jìn)胰島素分泌的葡糖糖濃度依賴性。

作用于胰島β細(xì)胞的KATP通道、Kv通道和VGCC這三種通道的藥物都會(huì)影響胰島素的分泌。而關(guān)閉KATP通道的藥物如臨床中常見的磺酰脲類降糖藥，其促進(jìn)胰島素分泌的途徑繞過了細(xì)胞內(nèi)葡萄糖代謝這一環(huán)節(jié)，降糖作用不依賴于體內(nèi)的血糖水平。而由于本實(shí)驗(yàn)中，替米沙坦在低糖濃度(2.8 mmol·L-1)下沒有增強(qiáng)胰島素分泌(Tab 1，2)。另外，在低糖濃度下亦未增加β細(xì)胞內(nèi)的鈣離子濃度，而作為陽性對(duì)照的KATP通道阻斷劑的磺酰脲類藥物甲苯磺丁脲干預(yù)后，卻明顯升高了β細(xì)胞內(nèi)的鈣離子水平(Fig 1)。這亦說明替米沙坦和甲苯磺丁脲作用于不同的靶點(diǎn)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)表明，替米沙坦通過影響β細(xì)胞的離子通道而發(fā)揮與既往文獻(xiàn)不同的調(diào)控胰島素分泌的作用，這為替米沙坦在治療糖尿病中的應(yīng)用展示了一個(gè)新的視野。同時(shí)，令我們感到欣喜的是，替米沙坦的促分泌作用是葡糖糖濃度依賴性的，不會(huì)出現(xiàn)一般的降血糖藥物的“低血糖”和引起“胰島細(xì)胞過度分泌”的副作用，這也將為葡萄糖濃度依賴性胰島素促泌劑的開發(fā)提供了一個(gè)新的思路。