TEM8在卵巢癌血管生成和侵襲遷移中的分子機制研究

張貴媛 羅翠華 李林株 吳玉燕 周素華

卵巢癌是我國較為常見女性生殖系統惡性腫瘤，卵巢癌其發病原因可能與致癌物質、自身免疫情況、體內激素水平、遺傳、環境等多因素有關，其發病率與死亡率均處于較高水平[1]。且在一些流行病學統計中，經手術及化療、放療治療后患者5年生存期仍不足30%[2]，因此國內外眾多學者也一直在積極尋找新的治療策略。其原因不僅是缺乏有效的治療手段，同時也是由于癌細胞的侵襲、遷移及造成大量腫瘤血管生成有關[3]。近些年來影響腫瘤血管生成已成為癌癥治療新的方向[4]。與VEGF不同，TEM8是一個在癌相關細胞中表達且在正常血管組織中未進行表達的因子[5]，因此本研究旨在通過建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，探究TEM8在卵巢癌血管生成和侵襲遷移中的分子機制，具體報告如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

SPF級BALB/C裸鼠20只，由江蘇艾菱菲生物科技有限公司提供。按隨機原則將裸鼠分為對照組與實驗組，每組10只。納入標準：（1）為BALB/C雌性裸鼠；（2）體質量為（20±3）g。排除標準：年齡＞5周或＜4周。

1.2 方法

1.2.1 實驗材料 TRIzol Reagent總 RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和實時定量聚合酶鏈反應試劑盒購自美國英杰公司；PCR基因引物合成購自上海生工生物工程股份有限公司；Transwell小室（0.4 μm）購自美國Corning公司；siRNA-TEM8購自北京華泰生物科技有限公司；BD Matrigel基質膠購自北京博蕾德生物科技有限公司；青霉素－鏈霉素雙抗購自美國Signa Alderich生物科技有限公司；胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.2.2 細胞培養 卵巢癌人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）細胞購自上海中科院細胞庫，將解凍后的細胞轉移至含1%青霉素、鏈霉素與10%胎牛血清的DMEM培養基中進行懸浮培養，在5% CO2、37 ℃恒溫條件下進行培養，當細胞處于對數生長期時進行傳代，其中部分細胞經siRNA-TEM8轉染。

1.2.3 癌組織體積及重量 采用標準飼料與飲用水喂養，飼養溫度保持在（25±2）℃，相對濕度保持在（40±2）%?？偣策M行適應性飼養7 d后進行實驗。對照組與實驗組分別向裸鼠腋窩中部外側皮下接種處于對數生長期的正常HUVEC細胞與沉默TEM8的HUVEC細胞100 μl建立卵巢癌皮下移植瘤模型，接種完成后繼續飼養14 d。飼養過程中對照組死亡2只，剔除；實驗組有2只裸鼠未成瘤，剔除；最終每組選取8只動物進行后續實驗。待模型建立完成2周后處死裸鼠，通過游標卡尺測量模型建立后各時期的腫瘤體積，隨后處死裸鼠并分離皮下卵巢癌腫瘤組織并稱重，根據組織腫瘤計算抑瘤率，抑瘤率=[（對照組平均瘤重-實驗組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%]。

1.2.4 實時熒光定量 PCR（real-time PCR） 將兩組卵巢癌組織分別置于液氮中磨碎，加入適量TRIzol試劑，通過勻漿機進行勻漿處理，隨后進行分層、沉淀、清洗及溶解等步驟制得RNA備用。隨后通過逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA，再通過實時定量聚合酶鏈反應試劑盒與TEM8、VEGF及CD34上下游引物混合離心，隨后于PCR儀上進行擴增，循環完成后做溶解曲線。以采集到的熒光信號值（Ct值）進行相對定量分析。引物信息（5’-3’）：TEM8上游引物TGCTGCACCACTGGAATGAAATC，下游引物CTCCTCCTGGCAGAACTTTCTGG；VEGF上游引物TCGAGACCCTGGTGGACATC，下游引 物 CACACAGGACGGCTTGAAGA；CD34上 游引物TCCTGCTGTGCAAAGTGTTC，下游引物AGTAAGGAGGAGGGGGAGAC；β-actin上游引物TCAGGTCATCACTATCGGCAAT；下游引物AAAGAAAGGGTGTAAAACGCA。

1.2.5 血管生成實驗 將BD Matrigel基質膠提前1 d放入4 ℃冰箱過夜，使其復溶成液態，次日取出膠體以 1 200 r/min 離心 5 min。離心后加入 6 孔板，在37 ℃恒溫箱放置45 min。隨后將經過處理的兩組細胞分別消化成細胞懸液后加入孔中，每孔200 ml，重復3孔，靜置一定時間，使所有細胞都沉淀至BD Matrigel基質膠表面后放入37℃恒溫箱中孵育12 h，結束后通過顯微鏡觀察血管生成情況。

1.2.6 Transwell試驗 將Transwell小室的上室中加入無血清的DMEM培養基并培養1 h使膜層親水，隨后棄去培養基，上室加入200 μl的HUVEC細胞懸液，隨后向下室按分組加入含有不同成分的培養基，每組設置5組復孔，將培養板置于培養箱中放置過夜。次日取出小室，用PBS清洗2次，加入濃度為5%的多聚甲醛在4 ℃條件下進行固定，隨后再次使用PBS清洗2次，加入0.1%結晶紫室溫條件下開始染色，放置5 min后于顯微鏡下觀察聚碳酸酯膜表面上下左右和中間5個視野范圍的細胞并計數，然后計算出每個視野范圍內的平均值作為各組細胞遷移數量。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 兩組腫瘤組織體積與重量比較

在建立模型2周內，可見實驗組裸鼠各時間點卵巢癌腫瘤體積均小于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、表1。模型建立2周后，實驗組裸鼠腫瘤平均重量為（0.185±0.021）g，明顯低于對照組的（0.317±0.032）g，差異有統計學意義（P＜0.05），其抑瘤率為（41.38±0.54）%。

圖1 各時間點兩組裸鼠卵巢癌腫瘤體積生長曲線

表1 兩組各時間點裸鼠卵巢癌腫瘤體積比較[mm3，（±s）]

表1 兩組各時間點裸鼠卵巢癌腫瘤體積比較[mm3，（±s）]

組別 2 d 4 d 6 d 8 d 10 d 12 d 14 d對照組（n=8） 128.6±5.5 138.1±6.4 169.2±6.5 190.2±13.7 201.6±16.3 236.9±12.1 255.8±29.8實驗組（n=8） 119.3±4.2 113.5±6.7 129.0±9.8 143.9±8.4 150.7±18.5 167.3±16.6 172.4±20.6 t值 4.250 8.396 10.810 3.977 6.528 10.714 7.280 P值 0.000 0.000 0.000 0.001 0.000 0.000 0.000

2.2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF及CD34水平比較

RT-PCR結果顯示，經TEM8沉默后，實驗組裸鼠卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平均明顯低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平比較（±s）

表2 兩組卵巢癌組織中TEM8、VEGF與CD34水平比較（±s）

組別 TEM8 VEGF CD34對照組（n=8） 1.325±0.172 1.084±0.098 1.129±0.092實驗組（n=8） 0.147±0.030 0.573±0.026 0.730±0.035 t值 19.083 14.255 11.465 P值 0.000 0.000 0.000

2.3 兩組HUVEC細胞腫瘤血管生成比較

血管生成實驗結果顯示，經處理的HUVEC細胞在BD Matrigel基質膠中孵育后，實驗組細胞管狀結構生成數量（22.5±4.4），明顯少于對照組的（53.7±8.2），差異有統計學意義（t=9.483，P＜0.05），見圖 2。

圖2 兩組細胞血管生成情況（×200）

2.4 兩組卵巢癌HUVEC細胞遷移與侵襲能力

Transwell結果顯示，沉默TEM8后，實驗組細胞遷移率為（12.5±2.3）%，與對照組細胞遷移率（32.7±6.2）%相比明顯較少，差異有統計學意義（t=8.640，P＜0.05）。

3 討論

卵巢癌細胞發生惡性增殖轉移是多步驟、多因素、多機制參與的過程，這與細胞侵襲和遷移等惡性生物學行為有關[6]。卵巢癌作為女性生殖系統發病率第三、死亡率第一的惡性腫瘤而受到廣大關注，通常情況下患者的5年生存率不超過45%。近些年來隨著醫療技術的不斷進步，越來越多的腫瘤治療方法從基礎研究發展成為臨床療法。其中手術治療聯合化療作為傳統的卵巢癌臨床治療技術雖然已經較為成熟，由于癥狀出現時往往是疾病的中晚期，因此卵巢癌的治療效果往往受到易復發轉移、新生血管生成等特點所產生的不良影響[7]，因此開發出新型的抗卵巢癌藥物，從靶點阻止卵巢癌血管生成與侵襲遷移是一種較為可行的辦法。

血管生成是指從現有的毛細血管生成新的血管的過程，血管生成是非常復雜而又重要的生物學過程，它是很多生物學功能的基礎，包括血管的發展、再生和修復等。血管生成是機體發育的正?，F象，但在腫瘤組織中，新生血管的生成往往與腫瘤發展具有緊密的聯系[8]。與正常的新生血管不同，腫瘤新生血管往往不具備完整的結構，是由血管盲端與體內動靜脈短路形成，并會使血管壁通透性增強，向腫瘤組織延伸。且腫瘤組織新生血管雖然尤為密集，但缺少組織供氧，這些微環境的變化會繼而引起癌細胞的侵襲與遷移。

在一些研究中，新生腫瘤血管生成后會引起腫瘤組織加速增長，且發生轉移的概率隨著腫瘤血管的增加而增加，因此抑制腫瘤血管生成或許能夠作為腫瘤治療的新的方向[9]。目前VEGF是國內外研究腫瘤血管生成的重要靶點[10]，與在血管中表達的VEGF及與在新生血管內高表達的CD34不同[11-12]，TEM8是近些年來被發現僅僅表達于腫瘤相關血管中的因子，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，能夠與細胞骨架蛋白相互作用從而介導細胞的運動如增殖、遷移及血管的生成，且在一些研究中發現TEM8在卵巢癌組織中高表達[13]。在本研究中，筆者通過沉默卵巢癌HUVEC細胞中的TEM8，觀察其表現。本研究結果顯示，在體內實驗中，沉默TEM8不僅能夠抑制腫瘤發展的速度與程度，同時能夠降低裸鼠卵巢癌組織中血管生成相關因子VEGF及CD34的表達水平。體外實驗結果同樣說明，沉默TEM8后卵巢癌HUVEC細胞的血管生成及遷移侵襲能力受到了明顯的抑制。

綜上所述，在本研究中卵巢癌組織中TEM8表現出的高表達水平提示TEM8或許擁有作為卵巢癌的治療靶點的潛力，此外低水平的TEM8能夠顯著抑制卵巢癌細胞的血管生成與侵襲遷移能力，進一步說明了TEM8可能以促腫瘤因子的身份作為卵巢癌的治療靶點。本研究為卵巢癌的分子靶向治療提供了一定依據。