高效液相色譜法同時(shí)測定華北獐牙菜中5種有效成分的含量

劉學(xué)良，劉安平，李維業(yè)，石春蘭，問靜，王永晶，祁彥凱，王開祥，陳鵬，韓達(dá)斌，劉海青*（.青海省藥品審評(píng)核查中心，西寧 80007；.西寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，西寧 80007）

華北獐牙菜別稱“烏氏當(dāng)藥”，在《中國植物志》[1]、《中國高等植物圖鑒》[2]、《藏藥志》[3]均有記載，為龍膽科植物獐牙菜屬華北獐牙菜Swertia wolfangianaGrun.的干燥花[4]。華北獐牙菜藏語名“代哇”，藏醫(yī)將其作為治療肝膽類疾病的藏藥材“桑蒂”的來源之一，通常在7～8月采其花，以紙遮蔽，曬干后使用，味苦、性寒，具有清熱利膽之功效，也用于治療流行性感冒[3-4]。華北獐牙菜生于海拔1500～5260 m的河谷階地、高山草甸、沼澤草甸、灌叢中及潮濕地，在西藏東部、四川、青海、甘肅南部、山西、湖北西部均有分布[5-6]。

目前，關(guān)于華北獐牙菜研究方面的研究文獻(xiàn)較少，主要集中在藥材資源整理、調(diào)查等方面[7-12]，未查到其有效成分分離鑒定、質(zhì)量控制等方面的文獻(xiàn)。本研究首次采用高效液相色譜法測定獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素5種有效成分的含量，方法操作簡便、有效，可為今后進(jìn)一步研究華北獐牙菜提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀，紫外檢測器（2489），Waters 2695型Empower 化學(xué)工作站（美國Waters 公司）；十萬分之一電子天平（METTLER TOLEDO），紫外可見分光光度計(jì)（PE Lambda 35，PE 公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品獐牙菜苦苷（批號(hào)：110785-201404，純度：98.3%），龍膽苦苷（批號(hào)：110770-201918，純度：97.1%），當(dāng)藥苷（批號(hào)：111742-200501，純度：99.2%），芒果苷（批號(hào)：111607-200704，純度：98.1%），異葒草素（批號(hào)：111974-200401，純度：94%）（中國食品藥品檢定研究院）。甲醇為色譜純，磷酸為優(yōu)級(jí)純，其余試劑為分析純；水為超純水。華北獐牙菜藥材均由項(xiàng)目組人員分別從青海玉樹市、同德縣、同仁縣采集，經(jīng)青海省藥品審評(píng)核查中心劉海青主任藥師鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[13-17]

Waters SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B）為流動(dòng)相，進(jìn)行梯度洗脫（0～5 min，10%～25%A；5～11 min，25%～45%A；11～25 min，45%～70%A；25～35 min，70%～80%A）；流速1.0 mL·min－1；檢測波長為254 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。在此色譜條件下，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素與樣品中其他成分分離度均大于1.5，理論板數(shù)龍膽苦苷峰計(jì)算不低于3000，見圖1。

圖1 華北獐牙菜HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms of Swertia wolfangiana Grun.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取對(duì)照品獐牙菜苦苷9.72 mg、龍膽苦苷9.03 mg、當(dāng)藥苷8.78 mg、芒果苷7.11 mg、異葒草素8.28 mg，分別置25、10、25、10、25 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。依次精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3、6、8、2、4 mL置25 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素對(duì)照品質(zhì)量濃度分別為0.0459、0.2104、0.1116、0.0558、0.0498 mg·mL－1的混合對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號(hào)篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理30 min（功率250 W，頻率50 kHz），取出，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取獐牙菜苦苷對(duì)照品5.56 mg、龍膽苦苷對(duì)照品19.67 mg、當(dāng)藥苷對(duì)照品10.98 mg、芒果苷對(duì)照品5.96 mg、異葒草素對(duì)照品5.62 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超聲使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品混合溶液。精密量取上述對(duì)照品混合溶液0.5、1、2.5、5、7.5 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，取上述溶液及對(duì)照品混合溶液分別注入液相色譜儀，測得峰面積。以對(duì)照品峰面積（Y）對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（X）為橫坐標(biāo)，用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程分別為Y獐牙菜苦苷＝9.409×105X＋1.760×103（r＝0.9993）、Y龍膽苦苷＝1.380×106X－4.007×103（r＝0.9996）、Y當(dāng)藥苷＝2.751×105X＋3.399×103（r＝0.9995）、Y芒果苷＝3.830×106X－2.903×104（r＝0.9999）、Y異葒草素＝2.440×106X－3.947×103（r＝0.9992）。進(jìn)樣量分別在0.0546～1.0930 μg、0.1910～3.8200 μg、0.1089～2.1780 μg、0.0584～1.1690 μg、0.0528～1.0570 μg與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素峰面積RSD分別為0.74%、0.61%、0.77%、0.85%、0.62%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（編號(hào)：HBZYC01），分別于0、2、4、8、16、24 h進(jìn)樣測定，記錄峰面積，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素峰面積RSD分別為0.85%、0.64%、0.77%、1.1%、0.69%，結(jié)果表明供試品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取華北獐牙菜樣品（編號(hào)：HBZYC01）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素平均含量分別為0.21%、2.54%、1.41%、0.73%、0.85%，RSD分別為0.62%、0.77%、0.64%、0.84%、0.60%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

稱取華北獐牙菜樣品（編號(hào)：HBZYC01）6份，每份0.1 g，精密稱定，置錐形瓶中，在每組中分別加入適量獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素對(duì)照品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定各成分的含量，計(jì)算回收率，結(jié)果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素的平均回收率分別為97.62%、97.04%、97.68%、95.66%、96.75%，RSD分別為1.3%、0.79%、0.53%、0.79%、0.92%（n＝6），表明該方法的回收率良好。

2.9 樣品含量測定

3批次華北獐牙菜藥材粉末各取約0.2 g，精密稱定，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣測定，計(jì)算各批次華北獐牙菜中各成分的含量。結(jié)果按干燥品算，3批次華北獐牙菜藥材中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草素含量分別在0.18%～0.24%、2.18%～2.99%、1.21%～1.55%、0.62%～0.81%、0.70%～0.91%，見表1。

表1 樣品含量測定結(jié)果(n＝3，%)Tab 1 Content determination (n＝3，%)

3 討論

3.1 檢測波長的確定

通過對(duì) 5種化合物甲醇溶液進(jìn)行全波長掃描，獐牙菜苷、龍膽苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草苷的最大吸收波長分別為250、275 nm，240 nm，255、350 nm，258、317 nm，270、348 nm。選擇254 nm為檢測波長時(shí)測定可兼顧5個(gè)成分最大吸收，且色譜圖基線平穩(wěn)，色譜峰峰形較好。故確定254 nm 作為本試驗(yàn)的檢測波長。

3.2 提取方法和色譜條件的優(yōu)化

通過對(duì)不同極性溶劑、提取方法、提取時(shí)間等因素進(jìn)行考察，確定樣品提取以甲醇為溶劑、超聲處理效率最高，提取時(shí)間確定為30 min。分別對(duì)甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等流動(dòng)相進(jìn)行考察，從混合對(duì)照品和樣品中被測成分的分離情況、基線的穩(wěn)定性及分析時(shí)間等方面綜合分析，最終選擇以甲醇-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫較為合適。

3.3 結(jié)果分析

華北獐牙菜中5種被測成分中龍膽苦苷的含量最高，在3批次樣品中的平均含量為2.57%，占5種被測成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)總和的45.01%。獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷、異葒草苷分別占3.68%、24.34%、12.61%和14.36%。另外，試驗(yàn)過程中還嘗試開展了華北獐牙菜中其他成分的含量測定試驗(yàn)，但由于含量較低、分離不好等原因，未進(jìn)行定量檢測。可見，華北獐牙菜中的環(huán)烯醚萜類及黃酮類化合物為其主要成分，而此類化合物的藥理活性頗為豐富，龍膽苦苷、獐牙菜苦苷、當(dāng)藥苷、芒果苷及異葒草素等化學(xué)成分，具有鎮(zhèn)痛、保肝利膽、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗病毒、降糖、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、抗氧化等廣泛藥理活性[18-22]，能與該藥材具有的清熱利膽、治療流行性感冒等功效相對(duì)應(yīng)。

本研究建立了華北獐牙菜中5種有效成分的HPLC 測定方法，該方法簡便、高效、準(zhǔn)確，可用于華北獐牙菜的質(zhì)量控制，為該藥材的綜合利用開發(fā)提供了參考依據(jù)。