GC-MS/MS法測定不同級別乳酸中殘留溶劑的含量

張悅，趙勇，鄭金鳳，劉雁鳴，謝瑩瑩*（1.湖南省藥品檢驗檢測研究院，長沙 410001；2.國家藥品監督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 410001）

乳酸（lactic acid）又名2-羥基丙酸，是一種天然存在的重要有機酸，作為消毒防腐劑、pH調節劑、助溶劑等，可用于肌內注射、靜脈注射、皮下注射、口服糖漿、片劑、外用和陰道用制劑[1-2]。

乳酸的微生物發酵生產過程中可能產生甲醇、乙醇等有機副產物，采用酯化水解法也可能使用甲醇和乙醇與乳酸成酯[3-4]。這些溶劑的殘留會對人體健康造成危害，控制其殘留量對保證藥品質量和用藥安全有重要意義。目前歐洲藥典（EP10.0）[5]規定了注射用乳酸中甲醇的限度（不得過50 μg·g－1），而我國尚未見乳酸中殘留溶劑檢測方面的相關報道。為考察國內乳酸中甲醇、乙醇殘留的整體情況，本研究根據《人用藥品注冊技術要求國際協調會質量部分》（ICH）[6]的指導原則（甲醇每日允許暴露量30.0 μg·g－1，乙醇每日允許暴露量50.0 μg·g－1）和《中國藥典》2020年版四部[7]中的相關規定，并參考相關文獻報道[8-10]，擬建立GC-MS/MS法測定乳酸中甲醇、乙醇的含量，并評價國內市場收集的33批乳酸的總體質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

8890-7010B GC-MS/MS色譜儀（美國安捷倫公司）；MS105DU 電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司，精度為十萬分之一）；VF-WAX ms毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）（美國安捷倫公司）；固定液為聚乙二醇（PEG-20 M）。

1.2 試藥

甲醇（純度≥99.99%，美國霍尼韋爾公司，批號：12G1H）；乙醇（純度≥99.9%，德國CNW Technologies GmbH公司，批號：E5450210）。33批乳酸樣品包括12批原料藥級、13批藥用輔料、5批食品級、2批工業級及1批進口高純級，詳細信息見表1。

表1 乳酸樣品信息Tab 1 Lactic acid sample information

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取甲醇、乙醇適量，精密稱定，用水溶解并稀釋成10 mg·mL－1的溶液，作為標準儲備液。再分別量取適量標準儲備液，用水配制成質量濃度為0、5、10、50、100、150 μg·mL－1的系列對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取乳酸0.5 g，精密稱定，置20 mL 頂空瓶中，精密加入5 mL 水溶解，即得。

2.2 色譜條件

程序升溫：初溫50℃，保持4 min，以30℃·min－1的升溫速率升至200℃，保持2 min；進樣口溫度220℃；載氣為高純He（純度＞99.999%）；流速2.0 mL·min－1，分流進樣，分流比5∶1；進樣量1.0 mL；頂空瓶平衡溫度80℃，平衡時間30 min，定量環溫度90℃，傳輸線溫度100℃。

2.3 質譜條件

采用電子轟擊離子源（EI），電子能量70 eV，離子源溫度230℃，溶劑延遲0.5 min，采用多重反應監測模式（MRM）掃描。甲醇：定量離子對為m/z32.1＞30.1，碰撞能量（CE）5 eV；定性離子對為m/z32.1＞28.1，碰撞能量5 eV。乙醇：定量離子對為m/z46.1＞45.1，碰撞能量5 eV；定性離子對為m/z46.1＞31.1，碰撞能量5 eV。

2.4 系統適用性試驗

精密量取“2.1”項下空白溶液（水）、對照品溶液和供試品溶液各5 mL，注入GC-MS/MS儀，記錄色譜圖，結果見圖1，空白溶液無干擾，各雜質能有效分離。

圖1 系統適用性色譜圖Fig 1 Chromatogram of specificity test

2.5 線性關系、檢出限與定量限

精密量取甲醇、乙醇標準儲備液，用水定量稀釋制成0、5、10、50、100、150 μg·mL－1系列對照品溶液，分別進樣，記錄峰面積。以質量濃度（x，μg·mL－1）為橫坐標，以峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程：y甲醇＝1.82x＋0.65，r＝0.9999；y乙醇＝3.99x－0.27，r＝0.9997。甲醇、乙醇在0～150 μg·mL－1內與峰面積呈良好的線性關系。采用信噪比S/N≈3計算檢出限，得甲醇、乙醇的檢出限分別為9.85、11.60 ng·mL－1；S/N≈10計算定量限，得甲醇、乙醇的定量限分別為32.83、38.67 ng·mL－1。

2.6 重復性試驗

取樣品（批號：CD190602C）0.5 g，置頂空瓶中，加入“2.1.1”項下對照品溶液（甲醇49.2 μg·mL－1，乙醇50.1 μg·mL－1）5 mL，平行制備6份，進樣測定，記錄色譜峰面積，計算甲醇、乙醇含量。結果甲醇平均含量為45.7 μg·mL－1，RSD為4.6%；乙醇平均含量為45.2 μg·mL－1，RSD為5.7%。說明本方法重復性好。

2.7 穩定性試驗

取 樣 品（批 號：CD190602C）5 g，置50 mL量瓶中，加對照品溶液（甲醇、乙醇：50 μg·mL－1）50 mL稀釋并定容至刻度，再精密量取5 mL，置頂空瓶中，于0、2、4、8、12、20 h進樣，記錄峰面積。結果供試品溶液在20 h內甲醇、乙醇峰面積的RSD分別為4.5%、5.3%（n＝6），表明方法穩定性良好。

2.8 回收試驗

取樣品（批號：CD190602C）約0.5 g，共6份，置頂空瓶中，精密加入對照品溶液（甲醇4.987 μg·mL－1，乙 醇5.132 μg·mL－1）5 mL，進樣測定。結果甲醇、乙醇平均回收率分別為93.5%（RSD＝4.0%）、89.8%（RSD＝4.3%），說明本法準確度好。

2.9 樣品測定

取33批乳酸樣品，按“2.1”項下方法制備，平行制備兩份，進樣測定，計算樣品中甲醇、乙醇含量，結果有2批次檢測出殘留溶劑，四川金川制藥有限公司200801批次的樣品檢出乙醇9.4 μg·mL－1，武藏野化學（中國）有限公司的樣品檢出甲醇8.7 μg·mL－1。

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

選擇質譜專用毛細管色譜柱DB-1 ms、HP-5 ms、DB-624 ms和VF-WAX ms進行試驗。結果顯示VF-WAX ms毛細管柱進行分離時，分離效果最好，且靈敏度較高，峰形最尖銳、對稱，故選用VF-WAX ms毛細管柱為色譜柱。

3.2 質譜條件的選擇

取10 μg·mL－1的甲醇、乙醇溶液進行MS1 Scan 模式全掃描，掃描范圍10～200 amu，通過譜庫檢索確定各成分，并選擇豐度最高的離子作為母離子（m/z32.1作為甲醇母離子，m/z46.1作為乙醇母離子）。再對母離子進行Product ion掃描，確定各產物離子的時間片斷和駐留時間，選擇豐度最高的特征碎片離子作為子離子。設定不同碰撞池電壓的運行序列（CE：3、5、8、10 V），優化子離子的最佳碰撞能量，建立MRM方法。

3.3 平衡溫度和平衡時間的考察

頂空氣體的濃度隨著平衡溫度的升高而升高，當瓶內處于氣液平衡后，各組分響應值趨于穩定[11-13]。本研究考察了不同溫度80、90、100、110℃下各組分的響應情況。發現甲醇、乙醇響應值隨平衡溫度升高而增大，但溫度升至90℃以后，響應值變化不明顯?？紤]到平衡溫度太高，頂空瓶氣密性變差，會影響測定結果的穩定性，故選擇90℃作為最佳的平衡溫度。在平衡溫度90℃條件下，對不同平衡時間20、30、40、50 min的平衡效果進行考察，發現甲醇、乙醇響應值隨著時間的增加而增加，當時間超過30 min后，響應值變化較小，故最終選擇30 min作為最佳的平衡時間。

3.4 國內市場中不同級別乳酸質量情況

本研究結果顯示，33批乳酸樣品中，僅1批樣品檢出乙醇（為藥用輔料級），1批樣品檢出甲醇（為進口高純級），其他樣品均未檢出殘留溶劑?！吨袊幍洹?020年版四部通則0861殘留溶劑測定法規定乙醇限度為0.5%，甲醇限度為0.3%；EP10.0規定注射用乳酸控制甲醇不得過50 μg·g－1。本研究33批次乳酸中的乙醇和甲醇殘留量均遠低于上述限度。說明國內市場中原料藥、藥用輔料、食品級、工業級、進口高純級等不同級別乳酸整體工藝控制良好，甲醇、乙醇殘留量較低。

甲醇是ICH中第二類溶劑，是非遺傳毒性動物致癌或可能導致其他不可逆毒性神經毒性或致畸形的試劑，為應限制的溶劑。本次研究收集到1批進口高純級樣品，且在這批樣品中檢出少量甲醇，故應多關注高純級樣品的溶劑殘留情況。另外研究中還發現，有藥品生產企業混用不同級別乳酸的情況，如將食品級（2021032931）乳酸當作藥用輔料級用于藥品生產中。故監管部門應多關注乳酸的混用情況，特別注意高純級乳酸用于藥品或食品市場中的溶劑殘留情況。