TRPV4在心血管疾病治療中的研究進展

邵俊蘭，焦小雨，唐春雷（江南大學生命科學與健康工程學院，江蘇 無錫 214000）

根據國家心血管病中心（School of Life Sciences and Health Engineering）近期發布的報告顯示，中國患心血管病的人數約3.3億，其中患腦卒中1300萬，冠心病1100萬，心力衰竭890萬，高血壓2.45億。2018年，心血管病死亡占我國城鄉居民總死亡原因的首位，在農村為46.66%，在城市為43.81%[1]。目前，市面上常有的心血管治療藥主要有五類，包括血管緊張素轉化酶抑制劑（angiotensin converting enzyme inhibitor，ACEI）、血管緊張素受體阻滯劑（angiotensin receptor blockers，ARB）、鈣通道阻滯劑（calcium channel blockers，CCB）、利 尿 劑、β-受體阻滯劑等。由于心血管治療藥全身性地作用于受體、通道和酶，缺乏較強的特異性，在廣泛應用于疾病治療的同時也會產生不良反應，比如高鉀血癥、電解質紊亂、直立性低血壓等。為減少不良反應，提升患者生活質量，近年來以TRPV4為靶點的藥物研究新方向已得到越來越多的重視。

瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）超家族由哺乳動物基因組中存在的28個TRP通道基因編碼，并根據DNA和蛋白質序列同源性分為七個亞家族：經典瞬時受體電位（transient receptor potential canonical，TRPC）， 瞬時受體M型（transient receptor potential melastatin，TRPM），瞬時受體錨蛋白（transient receptor potential ankyrin，TRPA），瞬時受體多囊蛋白（transient receptor potential polycystin，TRPP），瞬時受體粘脂蛋白（transient receptor potential mucolipin，TRPML）、無機械感受器電位C（no mechanoreceptor potential，NOMPC，TRPN）和瞬時受體香草素（transient receptor potential vanilloid，TRPV）[2]。TRPV可以進一步細分為6種亞型——TRPV1～6，其中，TRPV4蛋白在不同的血管內皮細胞中表達[3]，參與了多種血管功能，包括應答血流剪切力、調節血管張力、機械信號傳導、血管新生等。TRPV4功能障礙與許多病理生理狀態有關，本綜述就其在心血管疾病方面發揮的重要性進行探討。

1 TRPV4的結構

TRP通道是四聚體蛋白，大多數TRP是非選擇性陽離子通道，對鈉、氯、鉀和鈣具有高滲透性，但每種亞型都具有獨特的離子滲透性、電導和電壓依賴性，并被不同的配體或生理刺激激活。

人類的TRPV4基因位于染色體12q23-q24.1上，有15個外顯子，這些外顯子編碼組成全長含有871個氨基酸的蛋白質。TRPV4兩側是大的N端和C端結構域，中間是6個跨膜的α-螺旋結構域（S1～S6），其NH2末端附近有3個錨蛋白重復結構域（ankyrin-repeat domains，ARD），COOH端區域維持通道蛋白折疊、成熟和運輸，允許離子流動的孔位于S5和S6結構域之間[4]。孔打開和關閉以允許陽離子穿過膜，門控通常由一種或多種刺激（例如配體結合）控制。

2 TRPV4的功能與相關疾病

2.1 TRPV4的生理功能

2.1.1 調節血管通透性 通過激活TRPV4通道可以增加內皮 Ca2＋內流，同時激活肌球蛋白輕鏈激酶，刺激一氧化氮合成，并激活一氧化氮介導的負反饋回路，該回路通過環磷酸鳥苷（cyclic GMP，cGMP）依賴性衰減來增加血管通透性，從而保護血管屏障[5]。有研究通過觀察后肢缺血動物模型發現，TRPV4激動劑通過誘導缺血后肢的淋巴管生成來改善缺血后肢的血流，缺氧后肢的淋巴管生成促進Ca2＋通過TRPV4通道進入淋巴管內皮細胞，該研究表明通過激活TRPV4使淋巴管和血管中TRPV4上調將是治療周邊動脈阻塞性疾病的一個有效策略[6]。

2.1.2 維持細胞屏障 上皮屏障的特征在于細胞內緊密連接，而內皮屏障由細胞間緊密連接和/或黏附連接組成，這些連接限制了液體和蛋白質跨組織膜的細胞旁通道，而炎癥等病理生理狀態會破壞這些屏障的完整性。研究人員通過組織學觀察發現TRPV4缺陷（TRPV4－/－）小鼠的結合上皮細胞間隙較野生型（TRPV4＋/＋）小鼠寬，TRPV4－/－小鼠結合上皮的外源性示蹤滲透比TRPV4＋/＋小鼠更強，而對黏著小帶蛋白的免疫反應性比 TRPV4＋/＋小鼠更低。該研究表明TRPV4在結合上皮細胞黏附連接的形成中起重要作用，這種黏附連接可以調節其通透性[7]。

2.2 TRPV4通道異常的相關疾病

2.2.1 心力衰竭 內皮功能障礙是心血管疾病發病機制的第一步，也是心力衰竭患者病死率的重要預測因素。TRPV4在血管內皮細胞中廣泛表達，如主動脈、大動脈（例如頸動脈）和小動脈，以及靶器官（例如肺）中的毛細血管，TRPV4下調可能會導致血管緊張素Ⅱ誘導的內皮功能障礙。此外，TRPV4通道在血管生成和動脈發生中起重要作用，它參與了血流剪切應力引起的動脈側支生長，是治療主動脈閉塞或狹窄的有效靶點[8]。

心力衰竭不僅會影響心臟和血管，還會影響肺部，肺充血是心力衰竭的標志性特征之一。來自嚙齒動物肺部的證據表明，高肺靜脈壓誘導的肺水腫是由肺毛細血管內皮TRPV4通道的激活驅動的，Thorneloe等[9]研究進一步表明TRPV4在充血型心力衰竭患者的肺組織中表達增加。

2.2.2 肺動脈高壓 心力衰竭可分為左心衰竭和右心衰竭，其中，左心衰竭會引起全心衰竭，繼而累及右心室，從而出現肺動脈高壓。在肺動脈平滑肌細胞中，激活5-羥色胺受體可以導致TRPV4介導Ca2＋流入，可能介導肺動脈平滑肌細胞增殖[10]。有研究表明，TRPV4通道參與肺動脈高壓的外膜成纖維細胞活化和外膜重塑，該項研究首次證明了TRPV4通道在外膜重塑中的作用[11]。以上研究提示，TRPV4是治療肺動脈高壓的潛在有效靶點，值得進一步研究。

2.2.3 高血壓 研究表明，高鹽飲食誘發的心血管疾病（如高血壓）中TRPV4與血管張力的調節密切相關[12]。高血壓小鼠的TRPV4通道被抑制，無法介導Ca2＋內流入細胞內，繼而導致TRPV4在血管舒張中的作用被抑制。

在離體腸系膜動脈中的正常生理情況下，當內皮細胞受到刺激時，細胞膜上的TRPV4通道打開，引起胞外的Ca2＋內流，繼而引起下游的KCa2.3通道的打開，K＋外流，使得膜電位趨于極化，通過肌內皮間隙連接擴散到相鄰的平滑肌細胞，同時引起血管舒張[13]。研究發現，TRPV4與KCa2.3不僅是上下游的關系，兩者在生理和功能上相互作用，在內皮細胞中，兩者耦聯成為一個復合體，刺激內皮依賴性的超極化因子（endothelium derived hyperpolarizing factor，EDHF）介導的信號傳導和隨后的血管舒張。TRPV4-KCa2.3復合體相互作用，是高鹽飲食誘發的高血壓小鼠小動脈中EDHF介導的反應減少的基礎[14]。可見TRPV4-KCa2.3通道在高血壓疾病中發揮著重要作用。

2.2.4 急性肺損傷 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接致傷因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全。缺血再灌注誘導的水腫形成是肺移植后導致發病和死亡的最常見也是最重要的原因之一，最近一項在離體的灌注小鼠肺（iolated perfused mouse lungs，IPL）中進行的體外模擬實驗表明，與野生型對照相比，TRPV4缺陷型（TRPV4－/－）IPL的水腫形成增強，表明TRPV4對維持肺泡上皮屏障具有保護作用。該研究突出了TRPV4通道在肺泡上皮細胞和防止水腫形成方面的新的功能[15]。

3 TRPV4通路的激活和調控

3.1 TRPV4相關信號通路（見圖1）

圖1 不同外部刺激下的TRPV4信號通路Fig 1 TRPV4 signal pathway under different external stimuli

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）對絲氨酸162、絲氨酸189以及蘇氨酸175的磷酸化使表達TRPV4的人胚胎腎細胞293對低滲應激敏感；同時蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）對絲氨酸824的依賴性磷酸化使TRPV4通道蛋白對低滲應激敏感[16]。TRPV4激動劑4α-佛波醇-12，13-十二烷酸酯（4α-phorbol-12，13-didecanoate，4α-PDD）和溫度（＞27℃），可能會通過血清糖皮質激素蛋白激酶1（serum glucocorticoid protein kinase-1，SGK1）機制對TRPV4的824絲氨酸進行磷酸化[17]。在 HeLa細胞中，Src家族激酶對蘇氨酸110和蘇氨酸805的磷酸化也顯示出TRPV4對熱、剪切應力、低滲腫脹和4α-PDD敏感[17]。可見，磷酸化可以調節TRPV4活性以響應多種刺激。

3.2 TRPV4在體內的調控方式

3.2.1 依賴Ca2＋的調控方式 在平滑肌中，TRPV4被內皮衍生的代謝產物環氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoic acid，EET）激活，導致大的電導鉀通道激活和平滑肌超極化。內皮細胞在血管內穩態中起主要作用，其機制獨立于復雜的信號級聯。這一機制可將大量鈣離子快速轉運到細胞內，導致鈣依賴性一氧化氮（nitric oxide，NO）合成酶的激活，從而誘導NO的產生，引起NO依賴性血管舒張。已有研究證明在小鼠頸動脈細胞中，TRPV4通道可在完整的動脈內皮細胞中產生一個獨特的局灶性Ca2＋瞬變群體，表明它們在血管內穩態中起到重要的調控作用[18]。

3.2.2 滲透調節 TRPV4可以在細胞對低滲的反應中被激活，因此，它被認為是一種機械或滲透傳感器。TRPV4通過滲透壓的變化隨時監測細胞和響應環境，對細胞功能和生存至關重要。研究表明，細胞體積的變化是影響TRPV4活性的重要調節因子，細胞腫脹繼而導致該通道激活[19]。

3.2.3 機械調節 有研究團隊評估TRPV4在將小鼠膽管上皮細胞膜液流的機械作用轉化為Ca2＋濃度和膽汁分泌增加方面的潛在作用，證明了TRPV4是膽管上皮中的一個功能性機械敏感通道。TRPV4通過將液體流動轉化為細胞內鈣信號，是膽管機械敏感信號傳導的重要啟動者，也是膽管內膽汁形成所必需的頂端信號復合體的重要成員[20]。

4 TRPV4激動劑和拮抗劑

4.1 天然和合成激動劑

已發現的常見TRPV4激動劑有雙穿心蓮內酯A（bisandrographolide A，BAA）、4α-PDD、4α-佛波醇-12，13-二己酸酯（4α-phorbol-12，13-dihexanoate，4α-PDH）和GSK1016790A，其結構如圖2所示，均能有效激活人TRPV4。

圖2 已開發的TRPV4激動劑Fig 2 Developed TRPV4 agonists

4.1.1 BAA David E.Clapham團隊使用鈣成像分析篩選了50種中草藥的提取物庫，發現從穿心蓮中分離的提取物BAA可以激活TRPV4（EC50＝950 nmol·L－1），并且在完全激活TRPV4通道的濃度下對TRPV1～3通道沒有影響[21]。

4.1.2 4α-PDD和4α-PDH 4α-PDD是靶向TRPV4的合成化合物，研究發現TRPV4的S3～S4區域是形成4α-PDD激活通道的重要位點。隨后，新的 4α-PDD衍生物激動劑被設計和測試用于激活TRPV4通道。4α-PDH顯示出非常高的TRPV4激活功效（EC50＝70 nmol·L－1），其效力是4α-PDD的5倍，且比未修飾的4α-PDD更穩定。該研究表明，4α-PDD激活下的TRPV4通道在細胞外Ca2＋存在下會增加內皮細胞通透性，繼而引起血管舒張[22]。

4.1.3 GSK1016790A 葛蘭素史克公司通過篩選小分子文庫鑒定了另一種完全合成的TRPV4激動劑——GSK1016790A（EC50＝1～10 nmol·L－1）。GSK1016790A是TRPV4的特異性小分子激動劑，與傳統的4α-PDD（EC50在微摩爾范圍內）相比，它已被證明是一種更有效的激活劑（EC50在納摩爾水平）。研究表明，GSK1016790A在多種細胞類型中刺激TRPV4通道，包括內皮細胞、尿平滑肌細胞、尿路上皮細胞和過度表達TRPV4的HEK-293細胞[23]。濃度在1 nmol·L－1以上時，GSK1016790A在表達鼠源和人源TRPV4的HEK細胞中引發Ca2＋的流入（EC50分別為18和2.1 nmol·L－1），引起劑量依賴式的TRPV4全細胞電流的激活。GSK1016790A特異性激活TRPV4，引發質膜上該通道的表達下調、快速部分脫敏。但是由于TRPV1和TRPV4在 S3～S4 區域顯示出一定程度的相似性（60%同源性，40%同一性），GSK1016790A對 TRPV1也有一定的抑制作用（EC50＝50 nmol·L－1），在3個物種（小鼠、大鼠和狗）的動物實驗中，靜脈注射 GSK1016790A的確會導致血壓成劑量依賴性降低，但隨后會出現嚴重的循環衰竭，導致體內引起嚴重的血管效應，進而導致內皮屏障的破壞，并且這種循環衰竭是肺、腸和腎中嚴重血管滲漏和組織出血的結果[24]。因此，TRPV4激動劑不太可能成為有效的治療劑，限制了研究人員對激動劑的進一步研究開發。

4.2 TRPV4拮抗劑

已經報道了幾種非選擇性TRPV4拮抗劑，其中比較常見的拮抗劑見圖3。

圖3 已開發的TRPV4拮抗劑Fig 3 Developed TRPV4 antagonist

4.2.1 RN-1734 RN-1734對TRPV4通道具有選擇性，對于hTRPV4、mTRPV4和rTRPV4的IC50值分別為2.3、5.9和3.2 μmol·L－1[25]。

4.2.2 HC-067047 HC-067047是另一個被廣泛使用的TRPV4拮抗劑，在環磷酰胺誘導的膀胱炎小鼠和大鼠模型中顯示出增加膀胱功能的作用（IC50分別為133 nmol·L－1和17 nmol·L－1），對人TRPV4的IC50為48 nmol·L－1。研究表明HC-067047可阻斷人的肺動脈平滑肌細胞中的TRPV4電流和Ca2＋信號[26-27]。有研究首次發現，在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的抑郁小鼠模型中海馬體TRPV4顯著增加，使用 TRPV4 抑制劑 HC067047 或敲低海馬 TRPV4，可以減弱其抑郁行為。該研究也表明了TRPV4通道可能在改善神經炎癥介導的抑郁癥方面是一個潛在靶點[28]。

4.2.3 GSK2193874 葛蘭素史克公司于2017年報道了一種具有口服活性、特異性和選擇性的TRPV4抑制劑——GSK2193874，它通過重組TRPV4通道和天然內皮TRPV4電流來抑制Ca2＋內流[29]。在離體嚙齒動物和犬的肺中，GSK2193874可防止血管通透性增加以及肺動脈高壓引起的肺水腫。同時，當GSK2193874劑量高達30 mg·kg－1時，對大鼠的血壓或心率均無影響。此外，在急性和慢性心力衰竭模型中，GSK2193874預處理可以抑制肺水腫的形成并增強動脈氧合。GSK2193874同時具有優良的跨物種TRPV4效力，在大鼠中，其靜脈注射的清除率（CL）＝7.3 mL/（min·kg），口服給藥的半衰期（t1/2）＝10 h，生物利用度（F）＝31%；在狗中，其靜脈注射的CL＝6.9 mL/（min·kg），口服給藥的t1/2＝31 h，F＝53%。綜上，GSK2193874作為慢性口服藥物，具有清除率低、口服生物利用度高、對其他 TRP 通道選擇性好、無血流動力學影響等優良特點。這些歷史悠久的藥物已作為體內和體外藥理學工具被廣泛應用，但其仍存在一些選擇性問題和安全性問題，影響了其進一步的臨床研究。

4.2.4 GSK2798745 葛蘭素史克公司通過高通量篩選發現了另一TRPV4拮抗劑GSK2798745。2019年，GSK2798745因其良好的體內藥效動力學效應和臨床前安全性被報道，其在人體內的平均全身半衰期約為13 h，IC50＝1.8 nmol·L－1[30]。在健康志愿者和心力衰竭受試者中完成的Ⅰ/Ⅱa期試驗表明，其體外測定的效力值與肺水腫大鼠體內藥代動力學/藥效學模型預測的值一致，GSK2798745可以在很大程度上阻斷肺血管內皮細胞中的TRPV4通道。GSK2798745在健康志愿者（服用量達14 d）和心力衰竭患者（服用量達7 d）中均沒有觀察到明顯的安全問題，表明其可以在心力衰竭以及其他適應證的長期臨床研究中進行評估。迄今為止，GSK2798745是唯一一種在人體中進行研究的有效且具有選擇性的TRPV4抑制劑[31]。

5 小結與展望

心血管疾病及其引發的一系列并發癥給患者的生理和心理上都帶來巨大的痛苦。TRPV4在細胞中表達廣泛，尤其是在血管內皮細胞中的高表達，使其成為治療心血管疾病的潛在有效靶點，具有廣泛的應用前景。

當前TRPV4激動劑作為藥物的發展明顯滯后于TRPV4拮抗劑，這是由于TRPV4的不當激活會產生與內皮損傷和肺微血管通透性屏障破壞相關的急性循環衰竭。而當前的臨床試驗提示我們TRPV4拮抗劑可以治療充血性心力衰竭癥狀，以及其他涉及TRPV4的病理癥狀，其作為心血管疾病治療藥物具有很大的潛力。但TRPV4拮抗劑仍存在一些亟待解決的問題，一方面，已有的TRPV4拮抗劑在大多數情況下特異性較差，它們可能會作用于TRPV家族其他亞型而產生不良反應；另一方面，目前TRPV4拮抗劑數量非常有限，臨床研究報道較少。針對以上問題，開發特異性的TRPV4拮抗劑是目前的重要研究方向。在未來，期待更多的TRPV4拮抗劑的發現以及更多對TRPV4拮抗劑的臨床療效評價。