過氧化碳酰胺合成工藝的優(yōu)化

林新文，唐閃光，朱光冕，陳娜（.湖南省藥品審核查驗中心，長沙 4000；.湖南一格制藥有限公司，湖南湘潭 400；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙 400）

注射用過氧化碳酰胺是臨床上一種常用的靜脈給氧藥物[1]，由過氧化氫與尿素以氫鍵結(jié)合形成[2]。經(jīng)靜脈注射后，過氧化碳酰胺在體內(nèi)會先緩慢分解形成過氧化氫，在過氧化氫酶的作用下緩慢釋放出氧分子，從而改善機(jī)體缺氧情況[3]，可用于因缺氧所導(dǎo)致的多種急重癥的搶救與治療[4-6]。該產(chǎn)品自上市銷售以來，其安全性和有效性均獲得了廣大醫(yī)師和患者的認(rèn)同。隨著生產(chǎn)批次的積累，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品在貯存時穩(wěn)定性不佳，常出現(xiàn)炸瓶等不穩(wěn)定現(xiàn)象，而這都是由于過氧化碳酰胺原料本身不穩(wěn)定造成的，所以急需對過氧化碳酰胺原料工藝進(jìn)行優(yōu)化，以提高其穩(wěn)定性，進(jìn)而提高其制劑的穩(wěn)定性。

研究發(fā)現(xiàn)金屬離子、光照、溫度等因素[7-8]，都會使過氧化碳酰胺分解，導(dǎo)致其pH和含量發(fā)生變化。螯合劑作為一種常用的藥用輔料[9]，可通過與金屬離子以配位鍵連接形成含金屬離子的雜環(huán)結(jié)構(gòu)，來減少金屬離子對于藥品的影響[10-12]。因此，可通過在制備過程中添加金屬離子螯合劑[13]和pH調(diào)節(jié)劑[14]來增加過氧化酰胺的穩(wěn)定性和儲藏性能。基于此，本研究以過氧化碳酰胺pH、含量和收率為指標(biāo)，pH調(diào)節(jié)劑種類和添加量、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）添加量為因素，對其處方進(jìn)行優(yōu)化；以溶解水浴溫度、析晶溫度、干燥溫度為因素，對其制備工藝進(jìn)行優(yōu)化；采用長期穩(wěn)定性試驗和加速穩(wěn)定性試驗考察過氧化碳酰胺的穩(wěn)定性，可為過氧化碳酰胺原料生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

DMH-2型對開門干燥滅菌烘箱（南京長興制藥機(jī)械有限公司）；876A型數(shù)顯真空干燥箱（上海浦東躍欣科學(xué)儀器廠）；MA105DU型電子天平（精度：0.1 mg，梅特勒-托利多儀器有限公司）；SSW-600-2S型恒溫水浴鍋（上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；PHS-3C雷磁pH計（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；Labonce-250GS藥品穩(wěn)定性試驗箱（北京蘭貝石恒溫技術(shù)有限公司）。

1.2 試藥

尿素（批號：190305，湖南芙蓉制藥有限公司）；過氧化氫溶液（批號：191008、191009，成都明日制藥有限公司）；枸櫞酸（批號：100820170407）、乙二胺四乙酸二鈉（批號：102320190701）（湖南爾康制藥股份有限公司）；磷酸二氫鈉（批號：20210506，分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 過氧化碳酰胺制備原有工藝

稱取126 g濃過氧化氫溶液（折合H2O2為34.01 g）以及60.06 g尿素于燒杯中（使過氧化氫與尿素的摩爾比為1∶1），35℃水浴加熱攪拌溶解后保溫5 min，使其充分反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液經(jīng)0.45 μm的聚丙烯濾膜過濾后進(jìn)行冷卻析晶，冷卻至0～4℃時開始計時，低溫靜置析晶12～24 h，傾去母液得結(jié)晶1，母液按照上述條件進(jìn)行第二次結(jié)晶，棄第二次結(jié)晶后母液得結(jié)晶2，將結(jié)晶1和結(jié)晶2混合置于真空干燥箱中，30℃左右真空干燥24～36 h，即得過氧化碳酰胺（合成工藝見圖1）。

圖1 原有合成工藝路線Fig 1 Original synthetic process route

2.2 過氧化碳酰胺優(yōu)化工藝

稱取126 g濃過氧化氫溶液（折合H2O2為34.01 g）于燒杯中，依次加入乙二胺四乙酸二鈉0.12 g和枸櫞酸0.82 g，攪拌均勻，向攪拌后的溶液中加入60.06 g的尿素（使過氧化氫與尿素的摩爾比為1∶1），30～40℃水浴加熱攪拌溶解后保溫5 min，使其充分反應(yīng)。將反應(yīng)后的溶液經(jīng)0.45 μm的聚丙烯濾膜過濾后進(jìn)行冷卻析晶，冷卻至－4℃開始計時，維持析晶料液－7～0℃低溫攪拌析晶10～12 h，析晶完成后，將母液收集按照上述條件進(jìn)行二次析晶，晶體轉(zhuǎn)入過濾器中，經(jīng)200～400目尼龍篩布過濾，得過氧化碳酰胺濕品。將過氧化碳酰胺濕品鋪盤置于真空干燥箱中，30～40℃下真空干燥24～36 h，即得過氧化碳酰胺（合成工藝見圖2）。

圖2 優(yōu)化的合成工藝路線Fig 2 Optimized synthetic process route

2.3 過氧化碳酰胺質(zhì)量的評價指標(biāo)

2.3.1 過氧化碳酰胺pH測定 取樣品4.0 g精密稱定，加新沸過并放冷的超純水15 mL充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓苽涑纱郎y溶液，于25℃測pH值，測定3次，計算平均值。pH應(yīng)在3.2～3.7，確保產(chǎn)品符合質(zhì)控要求。

2.3.2 過氧化碳酰胺的含量測定 由于過氧化碳酰胺為過氧化氫和尿素的晶體加合物[15]，故本試驗中過氧化碳酰胺的含量均以其中過氧化氫的含量來計算。取樣品0.1 g精密稱定，置于碘瓶中，加水25 mL與冰醋酸5 mL溶解后，加碘化鉀2 g，鉬酸銨試液1滴，遮光放置10 min，用0.1 mol·mL－1的硫代硫酸鈉滴定，至近終點(diǎn)時加淀粉指示液3 mL，繼續(xù)滴至藍(lán)色消失，并將滴定的結(jié)果用空白試驗校正。每1 mL硫代硫酸鈉滴定液（0.1 mol·mL－1）相當(dāng)于1.701 mg的過氧化氫。

2.3.3 過氧化碳酰胺收率的計算 過氧化碳酰胺合成基本反應(yīng)方程式如下：

H2O2＋CH4N2O → CH4N2O·H2O2

收率（%）＝60.06×m/94.07×M×100%

式中m為實(shí)際產(chǎn)量（g），M為尿素質(zhì)量（g）。

2.4 過氧化碳酰胺處方的優(yōu)化過程

2.4.1 pH調(diào)節(jié)劑的種類 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二鈉，60.06 g尿素，pH調(diào)節(jié)劑1.0 g，水浴溶解35℃保溫，－4℃低溫攪拌析晶，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項下方法制備，“2.3”項下方法測定評價指標(biāo)，考察不同種類pH調(diào)節(jié)劑對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，pH調(diào)節(jié)劑種類對過氧化碳酰胺pH有很大影響，當(dāng)選用磷酸二氫鈉＋磷酸或單獨(dú)的磷酸作為pH調(diào)節(jié)劑時，樣品pH較高，第一次結(jié)晶收率較低。當(dāng)選用枸櫞酸為pH調(diào)節(jié)劑時，樣品pH較低，第一次結(jié)晶收率較高。故選擇枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑。結(jié)果見表1。

表1 pH調(diào)節(jié)劑對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 1 Effect of pH regulator on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.2 枸櫞酸的用量 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二鈉，60.06 g尿素，水浴保溫溫度35℃，冷卻攪拌析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下方法測定評價指標(biāo)，考察枸櫞酸添加量（0.64、0.82、1.00、1.18、1.36 g）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)枸櫞酸添加量為0.82 g和1.00 g時，過氧化碳酰胺含量和第一次結(jié)晶收率均較其他組高，而從添加外來物質(zhì)越少越好的角度考慮，本文選擇枸櫞酸添加量為0.82 g。結(jié)果見表2。

表2 枸櫞酸添加量對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 2 Effect of citric acid additive amount on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.3 螯合劑的用量 稱取126 g濃過氧化氫溶液，0.82 g枸櫞酸，60.06 g尿素，水浴保溫溫度35℃，冷卻析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下方法測定評價指標(biāo)，考察不同乙二胺四乙酸二鈉添加量（0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 g）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，隨著乙二胺四乙酸二鈉添加量的增加，過氧化碳酰胺第一次結(jié)晶后，含量呈下降趨勢，且添加量為0.12 g時結(jié)晶收率最高，綜合試驗結(jié)果和成本考量，后續(xù)工藝選擇最小添加量0.12 g。

2.5 過氧化碳酰胺制備工藝的優(yōu)化過程

2.5.1 水浴溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”項下最優(yōu)處方，固定冷卻析晶溫度－4℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項下方法制備（由于二次結(jié)晶收率較低，且結(jié)晶時間較長，故后續(xù)工藝均不再進(jìn)行二次結(jié)晶），考察不同水浴溫度（25、30、35、40、45℃）時尿素的溶解時間和溶解情況，結(jié)果見表4。結(jié)合溶解時間和溶解情況，后續(xù)工藝選擇30～40℃作為最佳水浴溫度。

表4 水浴溫度對過氧化碳酰胺溶解反應(yīng)的影響Tab 4 Effect of water bath temperature on dissolution reaction of urea peroxide

表3 螯合劑添加量對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 3 Effect of chelating agentadditive amount on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.2 析晶溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”項下最優(yōu)處方，固定水浴保溫溫度35℃，真空干燥溫度35℃，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下方法測定，考察不同析晶溫度（0～4℃、－4～0℃、－8～－4℃、－12～－8℃）對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)析晶溫度在4～－8℃時，可以析出細(xì)膩的結(jié)晶顆粒；隨著溫度降低，過氧化碳酰胺含量基本不變，收率呈逐步升高的趨勢；當(dāng)析晶溫度為－12～－8℃時，液面出現(xiàn)結(jié)冰情況，不能進(jìn)行攪拌；故后續(xù)工藝選擇0～－7℃為最佳析晶溫度。結(jié)果見表5。

表5 析晶溫度對過氧化碳酰胺pH、含量和收率的影響Tab 5 Effect of crystallization temperature on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.3 真空干燥溫度 稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”“2.5”項下優(yōu)化結(jié)果，固定水浴溫度35℃，析晶溫度0～－7℃，按“2.2”項下方法制備，按“2.3”項下方法測定，考察不同真空干燥溫度（30、35、40、45℃）對過氧化碳酰胺pH和含量的影響。結(jié)果顯示，隨著干燥溫度升高，干燥24 h的干燥失重和干燥36 h的干燥失重都呈逐步降低的趨勢，但在30～40℃溫度區(qū)間內(nèi)，干燥溫度對過氧化碳酰胺pH變化無影響，且在35℃時過氧化碳酰胺含量最大。故后續(xù)工藝選擇30～40℃為最佳真空干燥溫度。

表6 真空干燥溫度對過氧化碳酰胺pH和含量的影響Tab 6 Effect of vacuum drying temperature on pH and content of urea peroxide

2.5.4 結(jié)晶次數(shù)確認(rèn) 原工藝采用了母液兩次結(jié)晶合并后再真空干燥的工藝。此工藝可以小幅提高產(chǎn)品的收率，但是一次結(jié)晶收得的濕品，需等與母液再次過夜重結(jié)晶的濕品合并才能進(jìn)入真空干燥工序，一次結(jié)晶濕品的暫存時間偏長，不利于生產(chǎn)效率的提高。同時根據(jù)上述試驗結(jié)果，第二次的結(jié)晶收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于第一次的結(jié)晶收率，且第二次收得量很小，經(jīng)權(quán)衡利弊，可將原兩次結(jié)晶的工藝改為一次結(jié)晶的工藝，一次結(jié)晶后的濕品直接進(jìn)入真空干燥工序，結(jié)晶母液棄去不用。

2.6 最佳處方及制備工藝的驗證

稱取126 g濃過氧化氫溶液，按“2.4”“2.5”項下最優(yōu)處方及制備工藝制備過氧化碳酰胺。按“2.3”項下方法測定評價指標(biāo)。每份樣品平行操作3次，取平均值。結(jié)果顯示，優(yōu)化的處方和工藝制備的過氧化酰胺其pH、含量和收率均優(yōu)于原工藝處方，這表明新處方及制備工藝下生產(chǎn)的過氧化碳酰胺較原工藝穩(wěn)定，能獲得更高的收率，符合產(chǎn)業(yè)化要求。結(jié)果見表7。

表7 優(yōu)化的及原處方和工藝的驗證結(jié)果Tab 7 Verification of optimal and original formulation and preparation technology

2.7 樣品穩(wěn)定性試驗

2.7.1 長期穩(wěn)定性試驗方法 按“2.4”“2.5”項下最優(yōu)處方及制備工藝制得過氧化碳酰胺原料。按照2020年版《中國藥典》四部中“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”[16]，對于溫度特別敏感的藥物，長期試驗可在溫度（5±3）℃條件下進(jìn)行。取適量樣品，以市售包裝，（5±3）℃條件下放置6個月，分別在第0、3、6、9、12個月時取樣，按照2020年版《中國藥典》四部“原料藥物及制劑穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項目”，考察其性狀、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。結(jié)果顯示，過氧化碳酰胺性狀均為白色結(jié)晶狀，溶液呈澄清無色，其pH、干燥失重和含量與第0月相比均變化不大，表明其穩(wěn)定，符合產(chǎn)品生產(chǎn)需求。結(jié)果見表8。

表8 長期穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 8 Long-term stability test results

2.7.2 加速穩(wěn)定性試驗方法 按“2.4”“2.5”項下最優(yōu)處方及制備工藝制得過氧化碳酰胺。按照2020年版《中國藥典》四部中“原料藥物與制劑穩(wěn)定性試驗指導(dǎo)原則”[16]，對溫度特別敏感的藥物，預(yù)計只能在冰箱（5±3）℃內(nèi)保存使用，此類藥物的加速試驗，可在溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±5）%的條件下進(jìn)行。取適量樣品，以市售包裝，于溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±5）%的條件下放置6個月，分別在第0、1、2、3、6個月時取樣，按照2020年版《中國藥典》四部“原料藥物及制劑穩(wěn)定性重點(diǎn)考察項目”，考察其性狀、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。結(jié)果顯示，過氧化碳酰胺性狀均為白色結(jié)晶狀，溶液呈澄清無色，其pH、干燥失重和含量與第0月相比均變化不大，表明其穩(wěn)定，符合產(chǎn)品生產(chǎn)需求。結(jié)果見表9。

表9 加速穩(wěn)定性試驗結(jié)果Tab 9 Accelerated stability test results

3 討論

3.1 pH調(diào)節(jié)劑的選擇

過氧化氫作為一種極弱酸（Ka＝2.4×10－12），在自然狀態(tài)下極不穩(wěn)定，存在典型的自加速分解過程[17]。孫峰等[18]研究發(fā)現(xiàn)，隨著過氧化氫的pH值增加，反應(yīng)起始放熱溫度降低，熱失控危險性明顯增加，當(dāng)pH值增至7以上時，儲存的過氧化氫極不穩(wěn)定，極易發(fā)生熱失控。故過氧化碳酰胺儲存過程中pH值的穩(wěn)定，對過氧化碳酰胺的儲存性能有較大的影響。本研究通過單因素試驗探究了不同pH調(diào)節(jié)劑及其最佳添加量。結(jié)果表明枸櫞酸對產(chǎn)品pH具有較好的調(diào)節(jié)性，作為一種天然小分子有機(jī)酸，具有無毒無害，水中溶解性能好的優(yōu)點(diǎn)[19]，且可與二、三價金屬離子進(jìn)行螯合[20]，提高過氧化碳酰胺的穩(wěn)定性，因此本研究以枸櫞酸作為pH調(diào)節(jié)劑。

3.2 螯合劑的選擇

乙二胺四乙酸二鈉作為藥物中常用的金屬離子螯合劑，具有廣泛的配位性能[21]，對照品中的靶金屬具有很高的螯合效率[22]，幾乎與所有過渡金屬都能生成水溶性好且穩(wěn)定的螯合物，能有效防止藥物被金屬離子催化氧化[23]，增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性，且在高溫條件下依然穩(wěn)定[24]。故本研究選擇乙二胺四乙酸二鈉作為金屬離子螯合劑。

3.3 水浴溫度的選擇

基于過氧化碳酰胺制備處方的改變，本研究探討了在新處方下，過氧化碳酰胺制備的最佳工藝。結(jié)果表明在25～40℃，隨著溫度升高，尿素的溶解時間不斷減少，當(dāng)溫度達(dá)到30℃時，尿素已完全溶解；當(dāng)溫度達(dá)到45℃時，樣品表面產(chǎn)生汽泡。這是由于溫度升高有利于尿素溶解和合成反應(yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而提高過氧化碳酰胺的收率，但溫度過高會導(dǎo)致過氧化氫和過氧化碳酰胺分解[25]，因此選擇30～40℃作為最佳反應(yīng)溫度。

3.4 真空干燥溫度的選擇

此外，本研究還探討了真空干燥溫度對產(chǎn)品干燥失重、pH和含量的影響。結(jié)果表明，在30～40℃，隨著溫度的升高產(chǎn)品真空干燥的失重減少，當(dāng)溫度達(dá)到40℃、干燥時間36 h時，產(chǎn)品失重只有0.2%，說明此時已基本去除產(chǎn)品中的水分和揮發(fā)性物質(zhì)；且pH為3.6符合產(chǎn)品質(zhì)控要求。當(dāng)溫度進(jìn)一步升高時，產(chǎn)品干燥36 h的失重未再減少，但產(chǎn)品的pH升高，含量降低，說明此溫度下，過氧化碳酰胺已分解，不適宜進(jìn)行真空干燥。綜合試驗結(jié)果與能耗考量，選擇30～40℃作為真空干燥溫度。

本研究通過單因素試驗探討了過氧化碳酰胺制備的最佳處方及其工藝條件，穩(wěn)定性試驗表明新處方及工藝下所生產(chǎn)的產(chǎn)品均符合質(zhì)控要求，穩(wěn)定性好，可為過氧化碳酰胺原料生產(chǎn)產(chǎn)業(yè)化提供依據(jù)。