超高效液相色譜-三重四極桿質譜法評價白芍-甘草對抑郁大鼠大腦皮層中神經遞質含量的影響

杜暉，楊會鴿，劉鵬鳴，任靜（.西安市食品藥品檢驗所，西安 70054；2.空軍軍醫大學第二附屬醫院藥劑科，西安 70038）

抑郁癥是以顯著而持久的心境低落為主要臨床特征的慢性綜合性腦疾病。隨著生活與工作節奏的加快，抑郁癥的發病率逐年上升。全球抑郁癥患者約為3.4億，且患者數量還在以每年11.3%的速率增長[1-2]。5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）是中樞神經系統的神經遞質，它與應答反應和大腦血流變化的調節密切相關[3]。5-HT、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺（dopamine，DA）等單胺類神經遞質在正常生物體內存在動態平衡，參與抑郁發生的全過程[4]。分析這些單胺遞質可為包括抑郁癥在內的多種神經系統疾病機制的研究提供重要依據。通常這類神經遞質的檢測方法有液相色譜-電化學檢測[5-6]、熒光檢測[7-8]和質譜聯用法[9-10]。質譜法以其靈敏度高而特別適用于神經遞質類物質的定量分析。白芍、甘草是治療抑郁癥較常用的配伍組合，在四逆散、逍遙散和柴胡舒肝散等眾多古方中均有記載。本研究采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜（UPLC-MS/MS）法考察白芍-甘草藥對對抑郁大鼠大腦中神經遞質含量的影響，從而進一步探討這種變化與抑郁發生的關系。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Xevo TQ-S超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀（美國Waters公司）；Milli-Q Advantage超純水機（美國Merck Millipore公司）；MS105十萬分之一天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BSA124S-CW萬分之一天平（德國Sartorius公司）；HC-3018R低溫冷凍高速離心機（合肥科大創新股份有限公司）。

1.2 試藥

白芍和甘草飲片（市售藥材，產地陜西，經空軍軍醫大學第二附屬醫院孫濤副主任藥師鑒定為符合《中國藥典》2020年一部要求的合格飲片）；重酒石酸去甲腎上腺素（批號：100169-201103，純度：94.5%）、鹽酸多巴胺（批號：100070-201006，純度：100.0%）和5-HT（批號：111656-200101，純度：100.0%）對照品（中國食品藥品檢定研究院）；鹽酸丁螺環酮片（規格：5 mg，批號：20210509，江蘇恩華藥業股份有限公司）；4-乙基鄰苯二酚（4-EC，美國Sigma公司）；甲醇、乙腈、甲酸和乙酸（色譜純，德國Merck公司）；高氯酸和乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）（分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司）；健康SD大鼠（5～7周齡，約250 g，西安交通大學實驗動物中心，動物合格證號：SCXK2007-001）。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1 樣品溶液的制備 白芍飲片1000 g，10倍水合煎3次，減壓濃縮至每毫升相當于飲片2 g；白芍、甘草飲片各500 g，10倍水合煎3次，減壓濃縮至每毫升相當于飲片2 g。

2.1.2 蛋白沉淀溶液的制備 取高氯酸和EDTA-2Na適量，用水稀釋制成含0.1 mol·L－1高氯酸和0.1 mmol·L－1EDTA的蛋白沉淀溶液。

2.1.3 內標工作溶液的制備 精密稱取4-EC適量，用蛋白沉淀溶液配制成質量濃度為1 μg·mL－1的溶液。

2.1.4 混合對照品溶液的制備 精密稱取重酒石酸去甲腎上腺素、鹽酸多巴胺和5-HT對照品各10 mg，置同一100 mL量瓶中，加甲醇適量，振搖使溶解，用甲醇稀釋至刻度，作為儲備液；精密量取儲備液1 mL，置100 mL量瓶中，用蛋白沉淀溶液稀釋至刻度；再精密量取上述溶液0.2、0.5、1、2、5和10 mL，置100 mL量瓶中，分別加入內標工作溶液1 mL，用蛋白沉淀溶液稀釋制成約2、5、10、20、50和100 ng·mL－1的混合對照品溶液。

2.2 色譜-質譜條件

2.2.1 色譜條件 安捷倫 C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈（90∶10）；流速0.3 mL·min－1；柱溫30℃；進樣量1 μL。

2.2.2 質譜條件 電噴霧電離源（ESI＋）；接口溫度：300℃；脫溶劑溫度：250℃；加熱塊溫度：400℃；霧化器流量：3.0 L·min－1；干燥器流量：10.0 L·min－1；加熱器流量：10.0 L·min－1。質譜條件見表1。

表1 4種化合物的質譜分析參數Fig 1 MS parameters of the 4 compounds

2.3 慢性應激大鼠抑郁模型的建立

雄性SD大鼠50只，分籠飼養，隨機分成A～E 4組，每組10只。A為空白組，B為模型組，給予蒸餾水；C為陽性對照組，按照1.0 mg·kg－1劑量灌胃給予丁螺環酮；D和E分別為白芍組和白芍-甘草組，按照5 g·kg－1劑量灌胃給藥。采用長期不可預見性溫和應激建立慢性應激大鼠抑郁模型，除A組外，每組接受多種不同應激，包括禁食和禁水（24 h）、夾尾（2 min）、冰水游泳（5 min）、搖晃（2次·s－1，10 min）、擁擠（10只一籠）和晝夜顛倒，每日刺激1次，順序隨機，持續20 d。造模第21日，C～E組開始每日1次給藥，連續給藥14 d。在造模開始后，分別在每日下午4點稱量每只大鼠的體質量，比較每組大鼠在體質量增長方面的差異。

2.4 蔗糖偏嗜度實驗

蔗糖偏嗜度實驗在禁食和禁水12 h后進行，訓練開始前予大鼠適應飲用蔗糖水。訓練開始后，第1日在籠內放置兩瓶均裝有1%蔗糖水的水瓶；第2日放置一瓶1%蔗糖水，一瓶純水，并相隔2 h交換水瓶位置；第3日禁水禁食；第4日放置一瓶1%蔗糖水和一瓶純水，進行2 h飲水量測定。通過稱飲水瓶質量測定純凈水和蔗糖水飲用量，以快感缺乏的客觀指標蔗糖偏嗜度[蔗糖偏嗜度（%）＝蔗糖水飲用量/（蔗糖水飲用量＋純凈水飲用量）×100%]作為衡量標準，比較造模前后各組動物蔗糖偏嗜度的變化。

2.5 樣品溶液的制備

實驗結束24 h后將大鼠斷頭處死，分取大鼠大腦皮層組織，置于預冷的生理鹽水中洗盡其他殘留組織，輕輕擦干，記錄組織的質量。精密稱取約0.2 g，在冰浴內的玻璃勻漿管中勻至糜狀，加入約5 mL的蛋白沉淀液，12 000 g離心20 min，取上清液再次12 000 g離心20 min，取上清液按一定比例加入內標工作溶液，并定容至10 mL，即得。

3 結果

3.1 方法學驗證

3.1.1 線性范圍、檢測限和定量限 精密量取“2.1.4”項下的系列混合對照品溶液，分別注入UPLC-MS/MS，以主成分峰面積與內標峰面積的比值y對質量濃度x（ng·mL－1）進行線性回歸，分別以信噪比為3和10時，測定3種神經遞質的檢測限（LOD）和定量限（LOQ），具體見表2。

表2 3種化合物的線性方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限Tab 2 Linear equations，ranges，correlation coefficients (r)，LODs and LOQs of the three compounds

3.1.2 回收率和精密度考察 精密稱取大腦皮層樣品約0.20 g，置15 mL具塞離心管中，分別精密加入低、中、高3個濃度水平（0.2、0.5、2 μg·g－1）的混合對照品溶液，按“2.5”項下方法配制樣品溶液，計算平均回收率，結果見表3，3種神經遞質的平均回收率在83.7%～94.1%，RSD均小于9.0%。

表3 3種化合物的加樣回收率(%)Tab 3 Spiked recovery of the 3 compounds (%)

3.1.3 穩定性考察 將高濃度水平的回收率測試液保存在4℃環境中，并在6、12、24和48 h后進樣分析，3種化合物的含量變化小于7.2%，說明樣品溶液在48 h內保持穩定。

3.1.4 流動相的考察 考察0.1%乙酸-乙腈（A）、0.1%乙酸-甲醇（B）、0.1%甲酸-乙腈（C）和0.1%甲酸-甲醇（D）等4種流動相體系對待測化合物離子化強度的影響。由于實驗采用0.1 mol·L－1高氯酸作為蛋白沉淀溶液，故在水相中添加酸保持溶劑與流動相酸度大體一致，從而增強了色譜體系的穩定性。當水中添加乙酸時，5-HT的靈敏度較甲酸明顯降低；同時發現3種神經遞質在甲醇體系中塔板數略低，所以最終選擇0.1%甲酸-乙腈作為流動相體系。

3.1.5 樣品稀釋溶劑的選擇 實驗中分別考察了蛋白沉淀溶液、流動相和水溶液作為樣品稀釋溶劑，結果發現流動相和水溶液的質譜信號噪音較大，且重現性較差。最終確定0.1 mol·L－1高氯酸作為樣品稀釋溶劑。由于金屬離子會加速單胺遞質的氧化，故稀釋溶劑中加入0.1 mmol·L－1EDTA與金屬離子絡合。

3.1.6 專屬性考察 分取“2.1.2”項下蛋白沉淀溶液和“2.5”項下樣品溶液，按“2.2”項下色譜和質譜條件分析測定，結果如圖1所示，表明蛋白稀釋溶液在4種化合物峰位處均無干擾，該法具有良好的專屬性。

圖1 4種化合物的MRM圖Fig 1 MRM chromatograms of the 4 compounds

3.2 行為學測試

在應激之前，對照組大鼠蔗糖偏嗜度[（78.9±6.9）%]與模型組大鼠[（81.3±6.1）%]無明顯差異（P＞0.05）。造模34 d后，模型組大鼠反應遲鈍，活動減少，而陽性對照組、白芍組和白芍-甘草組大鼠上述情況均有改善。與空白組比較，模型組大鼠體質量增長明顯變慢（P＜0.01），蔗糖偏嗜度[（48.3±2.9）%]顯著降低（P＜0.01），提示大鼠造模成功；與模型組比較，陽性對照組體質量增長速率和蔗糖偏嗜度[（83.1±5.8）%]百分比均明顯提高（P＜0.01），顯著高于白芍組和白芍-甘草組（P＜0.05）。

3.3 樣品測定結果

如圖2所示，與空白組比較，模型組大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA含量均明顯降低（P＜0.01），結合行為學指標，說明造模成功。與模型組比較，陽性對照組和藥物組均能升高大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA的含量，其中陽性對照組變化最大，且白芍-甘草組相較于白芍組更接近空白組。

圖2 藥物對大鼠大腦皮層中5-HT、NE和DA含量的影響Fig 2 Effect of the drugs on the contents of 5-HT、NE and DA in the rat cerebral cortex

4 討論

本研究采用慢性不可預見性應激法建立抑郁大鼠模型，該法操作簡便、可靠性高。實驗結果表明抑郁癥的發病與5-HT、NE和DA等含量降低有密切關系。5-HT是抑郁病癥中最重要的神經遞質之一，它的降低可能引起抑郁發作。本研究選取的模型藥物5-HT再攝取抑制劑丁螺環酮是新型的一線抗抑郁藥物，它通過選擇性地抑制5-HT重攝取，增加突觸間隙內5-HT的濃度，發揮抗抑郁作用[11-12]。有研究表明，抑郁癥可能會抑制NE的合成和釋放，導致突觸間隙中NE濃度降低[13]。腦內NE代謝產物為3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇，其可作為評價抑郁癥發生及發展的指標，提示抑郁癥發生及發展與NE密切相關[14]。有報道稱，與正常人比較，抑郁癥患者前額葉、紋狀體和海馬等功能區的DA含量降低，相關突觸功能下調[15]。上述研究表明3種單胺類神經遞質的含量水平與抑郁癥的發病有著密切關系。

盡管治療抑郁癥的化學藥物不斷更新，但是均有不同程度的毒副作用，如起效慢、嗜睡、體質量增加等；遠期療效不確切且存在用藥依賴，復發率非常高，嚴重影響了在我國的臨床推廣和使用[16]。因此，尋求安全有效的治療抑郁癥的藥物是當前亟待解決的問題。中醫“抑郁”應歸為郁癥、虛勞等疾病。白芍具柔肝養血、斂陰止痛的功效，廣泛用于郁癥的防治[17-18]；甘草有健脾寧心、和中緩急、調和諸藥之功效[19-20]，兩者配伍肝脾同治，共奏緩肝和脾、益血養陰之功，為治療郁癥的常見組方。本研究結果表明，白芍-甘草配伍能顯著提高大鼠大腦皮層中的單胺類神經遞質的含量水平；白芍-甘草組方效果相較于白芍單藥更接近空白組，但在治療郁癥中白芍-甘草不同提取部位對結果的影響及協同作用機制尚不明確。

本研究通過優化流動相和前處理步驟，建立了UPLC-MS/MS同時測定5-HT、NE和DA等3種單胺類神經遞質的方法。研究表明，白芍-甘草藥對較模型組能顯著提升抑郁大鼠體質量增長速率和蔗糖偏嗜度百分比，并能提高抑郁大鼠大腦皮層中神經遞質的含量水平。