五步蛇蛇毒對脂多糖誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥反應的影響研究

曾曉艷，林雅麗，劉應蛟*，黃玉婷，龔力民，劉塔斯（.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，長沙 40000；.江西中醫(yī)藥大學藥學院，南昌 330004）

五步蛇又名蘄蛇，學名尖吻蝮蛇，屬于蝰科動物，主要分布在我國湖南、湖北、福建等黃河以南的地區(qū)，國外僅見于越南北部[1]。蛇毒是從毒蛇的毒腺中分泌出來的一種毒液，屬于生物毒素，是所有毒素中結(jié)構(gòu)最為復雜的一類物質(zhì)，其主要化學成分為毒蛋白、多肽和酶類等二十種以上的生物活性物質(zhì)[2]。在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)方面應用廣泛。隨著研究的不斷深入，分子生物學和蛋白質(zhì)組學的發(fā)展，蛇毒的一些有效成分被相繼提取并應用于臨床，在抗腫瘤、抗風濕、抗炎、抗凝血以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面均有較好的療效。

炎癥反應是一種重要的機體防御過程，實質(zhì)上是機體與致炎因子進行抗爭的反應，最終使機體的內(nèi)環(huán)境以及內(nèi)環(huán)境和外環(huán)境之間達到新的平衡。免疫細胞激活是炎癥反應的啟動環(huán)節(jié)。RAW264.7巨噬細胞是炎癥反應的重要效應細胞，在脂多糖（LPS）等外界因素刺激后能產(chǎn)生大量炎癥細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）和一氧化氮（NO）等[3]。近年來神經(jīng)毒素在抗炎方面的研究也成為一個熱點，認為神經(jīng)毒素能通過抑制多型核細胞的遷移產(chǎn)生一個長時程抗炎作用[4]。陶方方等[5]采用蘄蛇蛇毒對膠原誘導型關節(jié)炎大鼠血清TNF-α、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及金屬蛋白酶組織抑制物1（TIMP-1）的影響；蘄蛇毒素對大鼠佐劑性關節(jié)炎具有抑制作用[6]；蘄蛇提取物醇溶性和水溶性部位有一定的抗風濕關節(jié)炎作用[7]。目前蘄蛇蛇毒對炎癥的發(fā)生發(fā)展還不明確。LPS作為觸發(fā)炎癥的因子，LPS與巨噬細胞膜上的Tolllike受體接觸，刺激巨噬細胞，使巨噬細胞產(chǎn)生多種細胞因子和炎性介質(zhì)，動物機體在致炎因子的作用下發(fā)生炎癥反應[8]。此類致炎因子包括TNF-α、IL-6和NO等，對巨噬細胞發(fā)揮吞噬、抗原提呈及炎癥調(diào)節(jié)等功能具有重要作用[9-10]。因而本實驗采用LPS刺激RAW264.7細胞形成體外炎癥模型，考察不同濃度蛇毒對炎性細胞因子TNF-α、IL-6、NO分泌的影響，并初步探索其作用機制，為五步蛇蛇毒的深層次開發(fā)和利用提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞系

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7（普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 試藥

五步蛇蛇毒（簡稱蛇毒）取自湖南永州異蛇酒有限公司基地養(yǎng)殖的五步蛇，經(jīng)低溫保存，過濾處理，冷凍結(jié)成冰塊后進行干燥，再真空干燥，自制得到凍干粉[11]。

PBS 緩沖液（Procell，批號：PB180327）、胎牛血清（FBS，Procell，批號：SA190501）、青霉素-鏈霉素溶液（雙抗）（Procell，批號：PB180120）、DMEM高糖基礎培養(yǎng)基（Procell，批號：PM150210）、LPS（Solarbio，批號：426Y039）、噻唑藍（MTT，Solarbio，批號：309E0511）、二甲亞砜（DMSO，批號：20180105）（國藥集團化學試劑有限公司）；TNF-α、IL-6和NO檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；核轉(zhuǎn)錄因子p65抗體（NF-κB p65，批號：8242T）、核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制劑激活酶抗體（Iκ，批號：3416T）和核轉(zhuǎn)錄因子κB 抑制蛋白抗體（IκB，批號：76041T）（美國CST）；Affinity Purified Antibody peroxidase Labeled Goat anti-Rat lgG（H＋L）（美 國KPL， 批 號：10232580）；ECL發(fā)光液（北京普利萊基因技術有限公司，批號：P1050）。

1.3 儀器

LBI-150-L潔凈工作臺（蘇靜安泰空氣技術有限公司）；SW-CJ-1FD生化培養(yǎng)箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；NIB-100倒置顯微鏡（南京江南永新光學有限公司）；3111 CO2培養(yǎng)箱、1510酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司）；LE204E102電子天平（梅特勒托利多儀器有限公司）；DYCZ-40A電泳儀/轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 MTT法檢測蛇毒對RAW264.7 細胞的毒性

2.1.1 細胞處理 將RAW264.7細胞復蘇后，混懸于含10% FBS，1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d換液和傳代1次。

2.1.2 MTT法檢測細胞存活率 取生長狀態(tài)良好、密度達到80%～90%的RAW264.7細胞，密度為2×105個·mL－1、100 μL/孔接種于96孔板中，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。實驗分為空白對照（Kb）組和不同蛇毒濃度組（1、5、10、25、50、100、200、300 μg·mL－1），每組平行6孔。蛇毒用DMEM培養(yǎng)基配制，并用0.22 μm濾膜過濾。對照組換含10% FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，蛇毒組分別加入不同濃度的蛇毒，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后避光加入5 mg·mL－1MTT 100 μL于各孔中，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，恒溫振蕩器上振蕩10 min，用酶標儀于490 nm處測定其吸光度，計算細胞存活率（%）＝（實驗組平均OD值/對照組平均OD值）×100%。

2.2 細胞分組處理

參考“2.1.2”的實驗結(jié)果，取無細胞毒性的蛇毒濃度25、50和100 mg·L－1。取處于生長對數(shù)生長期的RAW264.7細胞（2×108個·L－1）移于6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。細胞分為空白對照（Kb）組、模型（LPS）組、蛇毒25、50和100 mg·L－1組，各組設3個復孔。除空白對照組外，其余組細胞蛇毒預處理2 h，然后加入LPS 1 mg·L－1，培養(yǎng) 24 h。吸取各組上清液，3000 r·min－1離心10 min，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA方法檢測蛇毒對TNF-α、IL-6 和NO炎癥因子分泌或生成的影響

取“2.2”項下上清液，采用小鼠 TNF-α、IL-6和NO檢測試劑盒測定上清液中 TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量。

2.4 Western blot法檢測 NF-κB p65、IκK、IκB的蛋白表達

取“2.2”項下上清液，用預冷的PBS 洗滌細胞后加入磷酸酶抑制劑（100∶1∶1）混合液，刮取貼壁細胞，冰上裂解 30 min，然后4℃、12 000 r·min－1，離心30 min，取2 mL上清液用于蛋白濃度測定，其余樣品加入4×Loading Buffer，95℃金屬浴5 min，－80℃凍存。選用10%Gel和5%SDS-PAGE濃縮膠進行電泳，完成后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5% TBST稀釋的BSA溶液室溫孵育2 h，加入一抗（1∶1000）過夜，TBST漂洗3次，每次10 min；加入二抗曝光。灰度掃描用Image J軟件定量分析蛋白條帶，以β-Actin作為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達變化。

2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)采用 Graphpad 軟件進行分析，組間比較采用雙尾t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。灰度掃描用Image J軟件定量分析蛋白條帶，以β-Actin作為內(nèi)參，檢測目的蛋白的表達變化。

3 結(jié)果

3.1 蛇毒對RAW264.7 細胞存活率的影響

結(jié)果見圖1，與空白對照組比較，蛇毒300 μg·mL－1組細胞存活率明顯降低（P＜0.05），當蛇毒質(zhì)量濃度在 0～200 μg·mL－1時，細胞存活率差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），即蛇毒對RAW264.7 細胞沒有毒性作用（見圖1）。綜合考慮選擇25、50、100 μg·mL－1作為蛇毒低、中、高劑量組進行后續(xù)實驗。

圖1 蛇毒對 RAW264.7 細胞活性的影響Fig 1 Effect of agkistrodon acutus venom on the cell viability of RAW264.7 cells

3.2 蛇毒對LPS刺激RAW264.7細胞分泌炎性細胞因子影響

與空白對照組相比，LPS組中的TNF-α、IL-6和NO分泌水平顯著增加（P＜0.001）。與LPS組比較，蛇毒25、50、100 μg·mL－1劑量組的TNF-α、IL-6 和NO分泌水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001），并且呈劑量依賴性，見圖2。

圖2 蛇毒對 TNF-α、IL-6 和NO分泌的影響Fig 2 Effect of agkistrodon acutus venom on the secretion of TNF-α，IL-6， and NO

3.3 蛇毒對LPS誘導RAW264.7細胞的中NFκB p65、IκK、IκB蛋白表達影響

與空白對照組比較，LPS組NF-κB p65及IκK蛋白表達顯著上調(diào)（P＜0.001），而IκB蛋白表達顯著下調(diào)（P＜0.001）。予以蛇毒干預后25μg·mL－1組的NF-κB p65及IκK蛋白表達顯著降低（P＜0.01），IκB蛋白表達沒有明顯變化（P＞0.05）；蛇毒50 μg·mL－1和100μg·mL－1組 的NF-κB p65及IκK蛋白表達顯著降低（P＜0.001），IκB蛋白表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.001），結(jié)果見圖3。

圖3 蛇毒對LPS誘導RAW264.7細胞的中NF-κB p65、IκK、IκB蛋白表達影響Fig 3 Effect of agkistrodon acutus venom on the protein expression of NF-κB p65，IκK，and IκB in RAW264.7 cells stimulated by LPS

4 討論

TNF-α是由單核細胞-巨噬細胞受到促炎因子的刺激后合成和釋放的一種關鍵性促炎性蛋白[11]，具有廣泛生物學活性的炎性介質(zhì)。TNF-α的生物活性受其濃度高低的影響，在正常情況下，機體內(nèi)TNF-α的濃度較低，有抗腫瘤、抗感染、促進B細胞增殖分化等多種生理功能，可調(diào)節(jié)免疫應答，是機體免疫防護的重要介質(zhì)；而當TNF-α濃度過高時，反而會作為重要的炎癥遞質(zhì)介導炎癥反應的病理生理過程，能增加微血管壁的通透性，并刺激中性粒細胞及內(nèi)皮細胞表面黏附受體，趨化中性粒細胞等炎癥細胞，啟動炎癥反應，介導感染引起的炎癥損害[12]。IL-6是機體T細胞經(jīng)過活化后分泌的一種重要免疫調(diào)節(jié)因子，與TNF-α相似，并且與TNF-α共同參與調(diào)節(jié)炎癥反應，作為一種促炎因子，為反映機體炎癥程度的重要指標[13]。NO是具有生物活性的氣體分子，其大量生成與炎癥密切相關，在急性炎癥部位會通過細胞毒性效應引起細胞損傷，進而引起炎癥相關疾病的發(fā)生和發(fā)展[3]。本研究采用ELISA法測定相關促炎因子的含量水平，結(jié)果表明，與模型組比較，蛇毒低、中、高劑量（25、50、100 μg·mL－1）組均可以通過抑制TNF-α和IL-6分泌以及NO釋放，從而達到抗炎的效果。提示蛇毒低、中、高劑量組的抗炎作用與其能夠抑制促炎因子TNF-α、IL-6和NO的釋放有密切關系。

核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）廣泛存在于細胞質(zhì)中，參與機體的炎性反應、免疫應答及細胞的生長調(diào)控等過程。在靜息狀態(tài)下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合形成復合體，被穩(wěn)定在細胞質(zhì)中而不能發(fā)揮其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的功能[14]。當細胞受到外源性刺激，如TNF-α、IL-1β、IL-6、NO、T細胞激活劑、生長因子及病毒感染等，NF-κB 誘導激酶（NIK）為IκK的上游激酶，NIK可引起IκKα與IκKβ相應位點的磷酸化，通過級聯(lián)反應，使IκBs 磷酸化而與NF-κB解離，致使NF-κB 被激活[15]。可見NF-κB信號通路對炎癥反應的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮著重要作用。王君燕等[16]證明獐牙菜苦苷對LPS誘導的炎癥模型中TNF-α、IL-6的生成具有抑制作用，其機制可能與抑制NF-κB通路相關因子p65、IKK-α的表達有關。陳譜等[17]認為芍藥苷可以阻止NF-κB通路激活，抑制軟骨細胞炎癥及延緩軟骨退變。趙康博等[18]認為30～240 mg·L－1辣椒堿可以顯著降低由LPS誘導的My D88和NF-κB mRNA的表達，提示辣椒堿的抗炎活性可能與NF-κB信號通路有關。本研究采用Western blot法檢測各組細胞中NF-κB p65、IκK及IκB表達水平。結(jié)果顯示，蛇毒50 μg·mL－1和100 μg·mL－1組NF-κB p65及IκK蛋白表達水平顯著降低（P＜0.001），而IκB表達顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）。

現(xiàn)代藥理研究認為蛇毒具有鎮(zhèn)痛（類似嗎啡樣鎮(zhèn)痛作用包括緩解惡性腫瘤疼痛、神經(jīng)痛和關節(jié)痛等），抗風濕，抗腫瘤以及神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療方面的作用[19]。目前，研究者們對于蛇毒粗毒應用于抗炎作用以及機制的研究報道甚少，本實驗采用LPS刺激RAW264.7細胞形成體外炎癥模型，觀察了蛇毒干預后LPS誘導的RAW264.7細胞 中NF-κB信號通路NF-κB p65、IκK、IκB表達含量變化，發(fā)現(xiàn)蛇毒可以顯著抑制LPS誘導的NF-κB信號通路激活。

綜上，本研究結(jié)果表明，五步蛇蛇毒可能抑制TNF-α和IL-6分泌以及NO生成，從而達到抗炎的作用，其作用機制可能是上調(diào)NF-κB p65及IκK表達水平，下調(diào)IκB表達水平，激活NF-κB信號通路來抑制炎癥反應的發(fā)生。