塞來昔布膠囊體內外相關性的研究

丁強，金波，2*，管志美，王彬，4，周莎莎，4，殷美園，劉雁鳴，劉翔*（.天地恒一制藥股份有限公司，長沙 40；2.湖南省骨關節疾病藥物工程技術研究中心，長沙 40；.湖南省藥品審核查驗中心，長沙 400；4.國家藥品監督管理局藥用輔料工程技術研究重點實驗室，長沙 4000；5.湖南省藥品質量評價工程技術研究中心，長沙 4000）

塞來昔布是輝瑞公司開發的可用于緩解骨關節炎、類風濕關節炎及治療成人急性疼痛的特異性環氧化酶-2抑制劑。與傳統的非甾體抗炎藥相比，其在保留較好療效的同時，可顯著減少胃腸道不良反應[1]，無論是急性創傷外傷導致的急性疼痛，還是外科手術后的止痛，都是理想的鎮痛藥物[2]。

隨著仿制藥質量一致性評價工作的日益深入，通過良好設計保證仿制藥與原研制劑質量的一致性十分重要，其中溶出度試驗作為評價固體制劑內在質量的重要手段，也是一種評價藥物在體內釋放和吸收的有效手段[3]。對于具有良好體內-體外相關性的藥物，可以通過測定體外溶出度來預測藥物的體內生物利用度，進而用于制劑的處方篩選和質量評價[4]，因此建立良好的具有體內外相關性的溶出曲線對于仿制藥的質量評價有重要的意義。根據生物藥劑學分類（BCS），塞來昔布屬于BCSⅡ類藥物，由于塞來昔布難溶于水，其溶出快慢會直接影響藥物在體內的吸收和利用。目前已有塞來昔布膠囊溶出曲線測定及生物等效性研究的文獻報道[5-8]，尚未見塞來昔布膠囊體內外相關性溶出曲線的研究，本文旨在以進口塞來昔布膠囊（西樂葆）作為參比制劑，通過篩選具有一定區分力的溶出曲線，并將不同溶出行為的自研制劑與參比制劑進行生物等效性研究，從而建立塞來昔布膠囊具有一定體內外相關性的溶出曲線，為仿制藥一致性評價提供依據。

1 材料

1.1 儀器

RT-600銳拓溶出儀（銳拓儀器設備有限公司）；PB-10 pH計（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；NewClassic MS105DU電子天平（梅特勒·托利多公司，精度0.01 mg）；MP1100B電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司，精度0.01 g）；FAVD-25智能真空脫氣儀（上海富科思分析儀器有限公司）；微孔濾膜（MCE，0.45 μm，天津市津騰實驗設備有限公司）；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）。

1.2 試藥

塞來昔布膠囊（規格：0.2 g，西樂葆，批號：L61633、N92682、T94942，Pfizer Pharmaceuticals LLC）；塞來昔布膠囊（規格：0.2 g，批號：170101、181201，天地恒一制藥股份有限公司）；塞來昔布對照品（純度：99.9%，批號：2.0，EDQM）；甲醇（色譜純，Sigma試劑公司）；磷酸三鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸、冰醋酸、氫氧化鈉、三水合乙酸鈉（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）；十二烷基硫酸鈉（SLS，分析純，湖北葛店人福藥用輔料有限責任公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，分析純，天津市光復精細化工研究所）；水為自制純化水。

2 方法與結果

2.1 pH-溶解度的考察

塞來昔布屬于BCSⅡ類即低溶解度高滲透性藥物[9-10]，其在pH值1.0～6.8的緩沖液中幾乎不溶。根據《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》，溶出介質通常采用水、0.1 mol·L－1鹽酸、緩沖液（pH 3～8）。本研究初步選擇在水、pH 1.0鹽酸、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液以及pH 12.0磷酸三鈉溶液中進行溶出介質的選擇，并測定了原料藥在不同pH介質及加入不同濃度的表面活性劑介質中的飽和溶解度，結果見表1。

表1 塞來昔布在不同介質中的飽和溶解度Tab 1 Saturated solubility of celecoxib in different media

結果表明，塞來昔布在pH 1.0鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液及水溶液中幾乎不溶，在pH 12.0磷酸三鈉溶液中極微溶解，相對于其他介質溶解度有明顯提高，在各介質中加入表面活性劑后，原料藥溶解度顯著提高。塞來昔布單次給藥的最高劑量為200 mg（D值），根據測定的飽和溶解度（S值），計算塞來昔布的D/S值，結果表明本品在各介質中溶解所需體積遠大于250 mL，為低溶解性藥物。

2.2 溶出度試驗條件的選擇

2.2.1 溶出方法的選擇 本品為常規膠囊劑，《普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則》中推薦溶出方法為槳法、籃法。美國食品藥品監督管理局（FDA）溶出度方法數據庫中塞來昔布膠囊的溶出方法為槳法，50 r·min－1，溶出介質是1%SLS的0.04 mol·L－1磷酸三鈉溶液（pH 12.0）1000 mL[11]。塞來昔布膠囊進口藥品注冊標準（JX20130156）[12]中溶出度方法也采用相同的方法，故首選槳法作為本品的溶出方法。

2.2.2 檢測方法的選擇 塞來昔布膠囊進口藥品注冊標準（JX20130156）中溶出度的檢測方法為高效液相色譜法（HPLC），檢測波長為256 nm。考慮到溶出曲線測定樣品檢測量較大，本研究選擇方便快捷的紫外-可見分光光度法（UV）進行考察。方法學研究結果表明塞來昔布具有較好的紫外吸收，并且輔料和膠囊殼不干擾塞來昔布的測定，塞來昔布在0.005～0.120 mg·mL－1與吸光度線性關系良好，方法精密度良好（RSD為0.73%），高、中、低三個濃度的樣品平均回收率均在98.52%～101.65%，回收率的RSD在0.84%～1.2%。

2.2.3 溶出介質的選擇 根據pH-溶解度考察結果，在滿足完全溶出的條件下，為了尋找具備良好區分力的溶出條件，選擇以1000 mL低濃度表面活性劑的緩沖液為介質進行溶出曲線的考察，結果如表2所示。

表2 參比制劑在5種不同介質中溶出度的考察Tab 2 Dissolution of reference drug in 5 different media

根據上述研究結果選用低濃度SLS，在滿足主藥溶出完全的情況下，又具有適當的區分力。最終確定的溶出介質為0.45%SLS的pH 1.0鹽酸溶液、0.35%SLS的pH 4.5醋酸鹽緩沖液、0.15%CTAB的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、0.4%SLS的水溶液和pH 12.0磷酸三鈉溶液。

2.2.4 樣品測定方法 取塞來昔布膠囊，采用槳法，溶出介質為0.15% CTAB的pH 6.8磷酸鹽緩沖液、0.4%SLS的水溶液和pH 12.0磷酸三鈉溶液1000 mL，轉速為50 r·min－1；另外以0.45%SLS的pH 1.0鹽酸溶液和0.35%SLS的pH 4.5醋酸鹽緩沖液1000 mL為溶出介質，轉速為75 r·min－1；分別在第5、10、15、20、30、45、60 min時，取溶出液10 mL，同時補充相同體積和溫度的溶出介質，0.45 μm濾膜過濾，棄去初濾液，精密量取溶出液續濾液1 mL，加溶出介質稀釋至20 mL，搖勻，作為供試品溶液。另取塞來昔布對照品適量，精密稱定，加甲醇-水（75∶25）溶液溶解并稀釋制成0.5 mg·mL－1塞來昔布，搖勻，作為對照品儲備液，精密量取對照品儲備液適量，加溶出介質定量稀釋制成0.01 mg·mL－1塞來昔布的溶液，作為對照品溶液。照UV法，在256 nm的波長處測定供試品溶液及對照品溶液的吸光度，按外標法以吸光度計算溶出量并繪制溶出曲線。

2.3 自研制劑與參比制劑的溶出曲線考察

根據《普通口服固體制劑溶出度試驗技術指導原則》，采用非模型依賴法相似因子（?2）來比較溶出曲線。?2可作為評價產品處方工藝變化以及與參比制劑間溶出曲線差異的評價參數，被FDA 推薦為比較兩條溶出曲線相似性的首選方法[13]，當?2在50～100，則認為兩者溶出曲線相似。為探索不同處方制備的自研制劑與參比制劑的體內外一致性情況，我們選擇采用不同SLS和聚維酮K30用量制備的兩組樣品進行研究，考察不同介質條件下自研制劑的溶出行為，兩組自研制劑處方組成如表3所示，自研制劑與參比制劑溶出曲線對比如圖1所示。

表3 不同處方組成研究Tab 3 Different formulations

圖1 自研制劑與參比制劑在不同溶出介質溶出曲線對比圖Fig 1 Dissolution curve of self-prepared drug and reference drug in different dissolution medium

結果表明，自研制劑（170101）與參比制劑（N92682），自研制劑（181201）與參比制劑（T94942）在上述5種介質中的溶出曲線相似因子?2值均大于50，表明自研制劑與參比制劑溶出曲線具有相似性。

2.4 自研制劑與參比制劑的生物等效性試驗

為進一步評價自研制劑與參比制劑的一致性，本試驗研究了健康受試者在空腹狀態下，單次口服兩種不同處方制備的膠囊與輝瑞制藥的塞來昔布膠囊的藥動學特征，比較兩制劑藥動學參數AUC和Cmax的差異，初步評估生物等效性，為制劑處方工藝是否需進一步優化提供參考。

采用單中心、空腹、隨機、開放、兩制劑、兩周期、雙交叉試驗設計，12例健康受試者按篩選號順序隨機分為A、B兩個給藥序列組，每周期單次口服0.2 g 參比制劑或受試制劑，周期間的洗脫期為7 d。給藥前禁食10 h以上，按照給藥方案空腹服用試驗制劑或參比制劑0.2 g（1粒），240 mL溫水送服，服藥前及服藥后1 h內禁止飲水，服藥后4、10 h統一進食標準午餐和晚餐。受試者分別于給藥前（0 h）及給藥后0.5、1、1.5、2、2.25、2.5、2.75、3、3.5、4、5、6、8、10、12、24、48 h采集靜脈血4 mL，血樣采集后置于肝素鈉抗凝試管內，于1 h內在4℃、1600 g離心10 min分離血漿，立即將血漿于－40℃冰箱中進行預凍，樣品在儲存冰箱中放置2～48 h后置－80℃冰箱保存。采用LC-MS/MS法測定血漿中塞來昔布的濃度，采用WinNonlin軟件非房室模型法計算塞來昔布的人體藥動學參數[8]，采用多因素多變量方差分析（ANOVA）進行個體間、制劑周期的顯著性分析。Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經對數轉換后進行方差分析，計算幾何均值比（GMR）的90%置信區間（90%CI），采用雙單側t檢驗方法進行等效性比較，等效標準為80%～125%。同時tmax進行Mann-Whitney U非參數檢驗。主要藥動學參數見表4，塞來昔布的平均血藥濃度-時間曲線見圖2。

圖2 自研制劑與參比制劑塞來昔布平均藥時曲線Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of celecoxib from the self-prepared drug and reference drug

表4 空腹口服塞來昔布膠囊的主要藥動學參數(±s)Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of oral celecoxib capsules under fasting condition (±s)

表4 空腹口服塞來昔布膠囊的主要藥動學參數(±s)Tab 4 Main pharmacokinetic parameters of oral celecoxib capsules under fasting condition (±s)

PK參數 處方A（n＝12） 處方B（n＝12）自研制劑170101 參比制劑N92682 自研制劑181201 參比制劑T94942 Cmax/（ng·mL－1） 571.70±177.41 699.71±340.52 939.18±586.05 835.133±438.01 AUC0～t /（h·ng·mL－1） 7109.77±2013.90 7845.15±3168.55 8321.115±3428.96 7832.075±3191.45 AUC0～∞/（h·ng·mL－1） 8121.46±3497.70 8190.31±3445.55 8504.523±3418.26 8031.94±3268.39 tmax/h 2.40±0.64 3.00±0.93 2.417±0.99 3.583±2.27 t1/2/h 14.46±8.53 9.70±2.91 9.026±2.684 8.744±2.75 MRT0～t /h 13.22±2.73 12.44±2.11 10.64±1.82 11.23±1.99 MRT0～∞/h 19.13±11.97 14.33±3.74 11.94±2.60 12.47±3.30

2.5 生物等效性試驗結果分析

多因素變量方差分析結果表明，自研制劑與參比制劑主要藥動學參數Cmax、AUC0-t、AUC0-∞、t1/2及MRT在個體間、制劑間、周期間差異均無統計學意義（P＞0.05），tmax值經Mann-Whitney U非參數檢驗亦表明不同制劑間差異無統計學意義（P＞0.05）。采用雙單側t檢驗進行等效性比較，結果表明，處方A與B制備的制劑與參比制劑的AUC0～t、AUC0～∞的GMR（90%CI）分別為82.20%～106.52%、89.80%～110.67%和92.71%～123.69%、93.33%～123%，均落在80.00%～125.00%，顯示具有生物等效性。而Cmax的GMR（90%CI）分別為68.54%～110.43%和104.52%～149.51%，表明不同處方條件下制備的自研制劑與參比制劑溶出速率存在差異。

3 討論

FDA溶出數據庫中塞來昔布膠囊測定的溶出介質為pH 12.0的磷酸三鈉溶液，并非為生理pH值條件，且添加1%SLS以達到漏槽條件。實際研究表明pH 12.0介質中不添加表面活性劑基本可以達到漏槽條件。從pH 12.0介質的體外溶出曲線來看，不同處方制備的樣品溶出曲線與參比制劑相似度較高，但從體內研究結果來看，兩者之間以及和參比制劑比較均存在一定的差異，結合體內外數據該介質條件不具備體內外相關性。塞來昔布在生理相關pH值介質中的溶解度非常低，所以FDA溶出數據庫中采用pH 12.0磷酸三鈉溶液（1%SLS）為溶出介質。

Cmax和AUC是反映受試制劑和參比制劑吸收速率和吸收程度的參數，生物等效性試驗的藥時曲線顯示處方A的自研制劑比參比制劑吸收速率慢，處方B的自研制劑比參比制劑吸收速率快。體外溶出曲線顯示自研制劑與參比制劑在0.45%SLS的pH 1.0鹽酸溶液、0.35%SLS的pH 4.5醋酸鹽緩沖液和0.15%CTAB的pH 6.8磷酸鹽緩沖液中具有很好的相似性，相似因子較高。在0.4%SLS的水溶液中，雖然兩制劑與參比制劑的溶出曲線?2值相對偏低（均在50左右），采用處方A的自研制劑比參比制劑溶出速度慢，而采用處方B的自研制劑比參比制劑溶出速度快，與體內研究的藥動學參數及藥時曲線變化趨勢基本一致，因此該介質條件可能具有一定的體內外相關性。

體外溶出曲線是一種評價自研制劑與參比制劑差異的重要方法，通過體內外充分研究，找出具有區分力的溶出曲線，才能在仿制藥處方工藝研究中科學評估自研制劑與參比制劑的差異。本研究所得的0.4%SLS的水溶液可能是具有區分力的溶出曲線，對塞來昔布膠囊的一致性評價及上市后持續質量評價均具有重要的參考指導意義。