基于電子舌技術(shù)與人工口嘗評(píng)價(jià)相結(jié)合的銀杏葉提取物掩味技術(shù)研究

薛婉瑩，李紅鑫，吳婧楠，孫常勝，李思潼，馬宏瑞，陳曉嬌，孫騰躍，郭杏梅，蔡程科*，王洪飛*（.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 0488；.北京量子高科制藥科技有限公司，北京 000）

中藥的成分極其復(fù)雜，包括生物堿類(lèi)、黃酮類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、苦味肽類(lèi)、糖苷類(lèi)、萜類(lèi)等成分，因成分復(fù)雜，異常苦澀，所以口感一直不太能被患者接受，找到能使中藥苦度降至大家普遍能接受的方法顯得尤為重要[1]。銀杏葉作為傳統(tǒng)中藥，具有活血化瘀、通絡(luò)止痛、斂肺平喘、化濁降脂等作用[2]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)發(fā)現(xiàn)銀杏葉提取物及其制劑對(duì)于治療心腦血管疾病[3]、阿爾茨海默病[4]和糖尿病腎病[5-6]等疾病具有顯著效果。

銀杏葉為銀杏科銀杏（白果樹(shù)、公孫樹(shù)）Ginkgo bilobaL.的干燥葉。一般為人工栽培，秋季葉尚綠時(shí)采收，及時(shí)干燥。銀杏葉中含有豐富的黃酮苷類(lèi)、萜類(lèi)、生物堿類(lèi)化合物，這些成分使得銀杏葉提取物的藥用價(jià)值和適用范圍十分廣泛。但其味道異常苦澀，大大降低了患者的服用適應(yīng)性，尤其是兒童，其味道可能會(huì)導(dǎo)致嘔吐等。所以對(duì)銀杏葉提取物進(jìn)行掩味是非常有必要的。一般情況下，傳統(tǒng)的掩味方式分為以下幾種：一種是通過(guò)添加掩味劑如高效甜味劑、香精等造成大腦對(duì)味覺(jué)的混淆，從而對(duì)苦味的敏感度降低；另外一種則是通過(guò)對(duì)制劑進(jìn)行處理如包衣，制成微囊等降低與味蕾接觸的藥量或藥物濃度，用于延緩或阻止藥物在口腔內(nèi)的溶解[7]。通常來(lái)說(shuō)添加掩味劑是最常用和最簡(jiǎn)單的掩蓋苦味的方法。通過(guò)前期的文獻(xiàn)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，紐甜、甜菊苷、阿斯巴甜等甜味劑能抑制鹽酸小檗堿、黃酮類(lèi)、生物堿的苦味[8-10]。

甜味物質(zhì)包含的化合物有很多，且具有各式各樣的化學(xué)結(jié)構(gòu)，例如糖（蔗糖、葡萄糖），糖醇（山梨醇、甘露醇、木糖醇），肽（阿斯巴甜），蛋白質(zhì)（單胞素）。甜味劑的效力被定義為蔗糖濃度與甜味劑濃度的比值。如蔗糖和葡萄糖被稱為低效價(jià)甜味劑，其甜味劑的效力約為1或更少（0.6～0.7）。另一方面，甜味劑效力超過(guò)10的甜味劑被稱為高效甜味劑，如紐甜、三氯蔗糖和阿斯巴甜。對(duì)于一些低效價(jià)甜味劑，如蔗糖和木糖醇，甜味強(qiáng)度隨著濃度的增加而增加。即使同樣的效果在低濃度的高效甜味劑時(shí)也會(huì)發(fā)生，但在高濃度的高效甜味劑下，甜味強(qiáng)度的增加會(huì)放緩至趨于穩(wěn)定。由于這些特性，低效甜味劑（如甘露醇和山梨醇）和高效甜味劑（如阿斯巴甜和糖精鈉）通常一起用于藥物中，以補(bǔ)充甜味度和改善飲用口感。本研究選擇了阿斯巴甜和紐甜、甜菊苷、三氯蔗糖這四種甜味劑，利用口嘗法和電子舌法探究其對(duì)銀杏葉提取物的掩味效果，并總結(jié)相應(yīng)的規(guī)律，為今后的中藥掩味奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

SA-402B型電子舌（日本Insent公司）；CP225D型電子天平（十萬(wàn)分之一，精度：0.01 mg，德國(guó)Sartorius 公司）；JOYN-SXT-02型索氏提取器（上海喬躍電子科技有限公司）；ADS-800型吸附樹(shù)脂（科海司北京科技有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海百典儀器設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

阿斯巴甜（北京維多化工有限公司，批號(hào)：20210424）；紐甜（深圳佳加甜味劑有限公司，批號(hào)：20210107）；三氯蔗糖（江西阿爾法高科制藥有限公司，批號(hào)：20210301）；甜菊苷（曲阜香州甜菊制品有限責(zé)任公司，批號(hào)：20201107）；銀杏葉：2月采于陜西楊凌，每次采收的銀杏葉都及時(shí)放入60～70℃的干燥箱中干燥24 h，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥制劑系蔡程科教授鑒定均符合2020年版《中國(guó)藥典》一部項(xiàng)下有關(guān)規(guī)定要求；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 銀杏葉提取物的制備

取約1 kg銀杏葉曬干磨成粉，浸于稀乙醇，用索氏提取器加熱回流提取，濃縮提取液并回收乙醇。將濃縮提取液用處理后的大孔樹(shù)脂進(jìn)行吸附，并用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行噴霧干燥，回收乙醇并不斷濃縮形成浸膏。最后真空干燥，粉碎形成粉末，制得銀杏葉提取物粉末。

2.2 鹽酸小檗堿溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿10 g，加水配制成質(zhì)量濃 度 為0.00、0.01、0.05、0.10、0.50 mg·mL－1的參比液。

2.3 確定苦度評(píng)價(jià)等級(jí)

結(jié)合銀杏葉的自身特點(diǎn)和查閱文獻(xiàn)[11]，確定了苦度值分為五個(gè)等級(jí)，見(jiàn)表1，取“2.2”項(xiàng)下的鹽酸小檗堿溶液（參比液），給志愿者進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，培訓(xùn)如何對(duì)藥品的苦味進(jìn)行評(píng)價(jià)。

表1 苦味評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Tab 1 Criteria for bitterness evaluation

2.4 樣品制備

2.4.1 陽(yáng)性參比液的配制 取800 g自制的銀杏葉提取物，加水至8 L，充分溶解，過(guò)濾后，制得陽(yáng)性參比液。根據(jù)志愿者口嘗后的綜合評(píng)分得陽(yáng)性參比液的苦度值為5，口感評(píng)價(jià)為：不能忍受的苦味，且后味非常持久。陽(yáng)性參比液的苦度值之所以選擇5是因?yàn)檫x擇3或4的話加入掩味劑之后苦度值的下降并不會(huì)非常明顯。

2.4.2 含有掩味劑的樣品溶液的制備 取“2.4.1”項(xiàng)下方法制備而成的苦味原液16份，每份400 mL，分別加入紐甜：1.25、2.5、3.75、5 mg·mL－1；三氯蔗糖：5、6.25、7.5、8.75 mg·mL－1；阿斯巴甜：5、7.5、10、12.5 mg·mL－1；甜菊苷：5、10、20、25 mg·mL－1，即得。

2.5 志愿者篩選

經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)同意審批后，選擇20名身體健康的志愿者（10名男性，10名女性），對(duì)其進(jìn)行了嚴(yán)格的苦味敏感度篩查，并簽署了知情同意書(shū)。

2.6 口嘗評(píng)價(jià)法

2.6.1 評(píng)價(jià)方法 本實(shí)驗(yàn)采用口嘗評(píng)價(jià)＋排序法，這是非常常用的評(píng)價(jià)苦味的方法。首先要先對(duì)陽(yáng)性參比液即未添加掩味劑的溶液進(jìn)行口嘗法評(píng)分。首先取30 mL的陽(yáng)性參比液置于紙杯中，由志愿者含入口中，從舌尖至舌根充分感受參比制劑的味道維持20 s，吐出后漱口5次，在志愿者充分感知苦味的時(shí)候告知其苦度分級(jí)及具體的苦度值。漱口后，確定口中完全無(wú)苦味的情況下，方可再次測(cè)定樣品的苦度值。

參照陽(yáng)性參比液的測(cè)試方法，每輪實(shí)驗(yàn)給志愿者測(cè)試4個(gè)樣品，按照苦度值從低到高的順序給樣品排序，并結(jié)合陽(yáng)性參比液的苦度值給每個(gè)樣品一個(gè)具體的苦度值，并把志愿者給出的結(jié)果記錄在藥物苦味評(píng)分表中。每次志愿者測(cè)試完一個(gè)樣品之后皆要漱口5次，待口中完全沒(méi)有苦味之后1～2 min才能測(cè)試下一樣品。每?jī)奢啒悠分虚g志愿者休息1 h，并且要保證本實(shí)驗(yàn)志愿者測(cè)試的樣品是隨機(jī)、單盲的。

2.6.2 異常值的剔除 由于本實(shí)驗(yàn)中含有生物樣本，且每個(gè)受試者之間也會(huì)存在個(gè)體差異，故導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果中會(huì)有異常值。Grubbs檢驗(yàn)法用來(lái)判斷實(shí)驗(yàn)誤差，并可將測(cè)試結(jié)果中的異常值剔除。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，顯著水平α＝0.05的方式剔除離群值，每一組每一輪僅剔除一個(gè)異常值，剔除之后不再進(jìn)行補(bǔ)充測(cè)試。

3 電子舌測(cè)定

3.1 SA402B型電子舌簡(jiǎn)介

SA402B型電子舌（日本Insent公司）是一種類(lèi)脂膜電位型電子舌，類(lèi)脂膜由多種電位型電極組成，與人體味蕾細(xì)胞的細(xì)胞壁脂質(zhì)膜類(lèi)似，能夠感知區(qū)別不同的樣品溶液，感知基本的味道，進(jìn)而辨識(shí)不同的物質(zhì)。

3.2 儀器參數(shù)

采用苦味分析系統(tǒng) BT0、AN0 共 2 個(gè)傳感器及 1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)電極。傳感器經(jīng)活化、校正后測(cè)樣。見(jiàn)表2。

表2 傳感器說(shuō)明Tab 2 Descriptions of sensor

3.3 電子舌測(cè)試程序

3.3.1 樣品處理方法 將35 mL樣品置于50 mL離心管超聲20 min，待充分溶解后測(cè)試，將待測(cè)樣品稀釋10倍后取35 mL樣品置于電子舌特定樣品杯中測(cè)試。

3.3.2 SA402B 型電子舌測(cè)試 平衡：傳感器先在清洗液中清洗90 s，陽(yáng)性參比液清洗120 s、繼續(xù)用含有酒石酸的氯化鉀溶液（精密稱取1.12 g氯化鉀和0.024 g酒石酸，溶于250 mL蒸餾水中，充分溶解后置500 mL量瓶中定容）清洗 120 s，傳感器在平衡位置歸零30 s。

測(cè)試：測(cè)試時(shí)間30 s，輸出先味值；后用含有酒石酸的氯化鉀溶液清洗3 s，傳感器插入新的陽(yáng)性參比液中測(cè)試回味30 s，循環(huán)測(cè)試4次，去掉第一次循環(huán)，取后3次平均數(shù)據(jù)作為測(cè)試結(jié)果。

4 結(jié)果與討論

4.1 口嘗法評(píng)價(jià)不同掩味劑對(duì)銀杏葉的掩味結(jié)果

對(duì)“2.4.2”項(xiàng)下方法制備的樣品進(jìn)行口嘗法測(cè)試，通過(guò)Grubbs的檢驗(yàn)，用t檢驗(yàn)評(píng)價(jià)得到不同濃度不同掩味劑對(duì)于銀杏葉陽(yáng)性參比液掩味前后的差別，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度不同掩味劑的苦度值結(jié)果Fig 1 Bitterness of different masking agents at different concentrations

4種掩味劑抑制苦味的效果和濃度變化的趨勢(shì)是一致的，隨著質(zhì)量濃度逐漸增大，苦度值隨之減小。紐甜在質(zhì)量濃度1.25～5 mg·mL－1時(shí)對(duì)于銀杏葉的掩味效果變化最為顯著，三氯蔗糖和阿斯巴甜對(duì)銀杏葉苦味的掩味效果相當(dāng)，甜菊苷對(duì)銀杏葉苦味沒(méi)有明顯的掩味效果。

隨著紐甜用量的增多，雖然銀杏葉的苦味有明顯下降，甜度逐漸上升，在紐甜質(zhì)量濃度超過(guò)3.75 mg·mL－1時(shí)，據(jù)口嘗者反饋，甜度過(guò)高，逐漸影響口嘗者喜好，其甜苦相間的口感會(huì)使得口嘗者感到不適。綜合苦度值的下降和口嘗者的描述，紐甜作用在銀杏葉掩味的最佳質(zhì)量濃度為3.75 mg·mL－1。

對(duì)紐甜、三氯蔗糖、甜菊苷和阿斯巴甜的4種濃度對(duì)數(shù)與苦度降低值進(jìn)行線性擬合，結(jié)果見(jiàn)表3，4種掩味劑在實(shí)驗(yàn)濃度下掩味效應(yīng)與濃度的關(guān)系符合韋伯-費(fèi)希納定律，這說(shuō)明感覺(jué)強(qiáng)度與濃度的對(duì)數(shù)是成正比的，銀杏葉苦度值的下降與掩味劑的濃度也成正比。

表3 4種掩味劑的苦度降低值與濃度間的關(guān)系模型擬合方程Tab 3 Model fitting equation for the relationship between bitterness reduction and concentration of 4 taste masking agents

4.2 電子舌法評(píng)價(jià)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)陽(yáng)性參比液和加入不同濃度掩味劑的樣品進(jìn)行電子舌測(cè)試，測(cè)得BT0堿基鹽類(lèi)苦味和AN0堿性苦味。

電子舌對(duì)陽(yáng)性參比液的AN0的測(cè)試結(jié)果為－1.14，說(shuō)明AN0傳感器對(duì)于銀杏葉的苦味并無(wú)響應(yīng)，加入不同的掩味劑結(jié)果也是負(fù)數(shù)，說(shuō)明AN0傳感器得到的結(jié)果不能作為掩味效果的依據(jù)。電子舌對(duì)陽(yáng)性參比液的BT0測(cè)試結(jié)果為6.09，銀杏葉和加入不同的掩味劑的樣品均對(duì)BT0傳感器有明顯響應(yīng)，見(jiàn)表4。紐甜和甜菊苷隨著濃度的增大苦度值Ie也增大，但對(duì)于三氯蔗糖和阿斯巴甜來(lái)說(shuō)隨著濃度的增大Ie是減小的。所以本文選擇BT0傳感器進(jìn)行研究。紐甜的濃度變化引起的BT0苦味值變化最為劇烈，所以可以初步判斷紐甜對(duì)于銀杏葉的掩味效果最為明顯。

表4 各掩味劑BT0堿基鹽類(lèi)苦味結(jié)果Tab 4 Bitterness of BT0 base salts of each taste masking agent

5 討論

人工口嘗法得到的結(jié)果是紐甜對(duì)銀杏葉的掩味效果最佳，紐甜有高甜度、無(wú)后苦、低熱量等優(yōu)點(diǎn)，并且對(duì)多類(lèi)中藥都具有較好的掩味效果，人的感官在分辨力和敏感度等方面均存在個(gè)體差異，對(duì)于甜度的喜好也各不相同，所以掩味的時(shí)候不是甜度越高越好，應(yīng)當(dāng)設(shè)置一個(gè)合理的范圍。電子舌是一種新興的仿生儀器，多應(yīng)用于食品口感評(píng)價(jià)[12]和藥物味道辨識(shí)[13-14]等方面，有關(guān)電子舌在評(píng)價(jià)藥物的掩味方面的研究相對(duì)較少，尤其是中藥，更缺乏相對(duì)豐富的理論與技術(shù)支持。如同本實(shí)驗(yàn)，在結(jié)合人的感官評(píng)判和電子舌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果后，也發(fā)現(xiàn)了一些問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)所選擇的掩味劑和陽(yáng)性參比液都是比較簡(jiǎn)單的體系，比較容易從電子舌的測(cè)試結(jié)果中找出規(guī)律，但是并不是所有的苦味傳感器都能有所響應(yīng)，考慮AN0傳感器不能應(yīng)答的原因可能與掩味劑及銀杏葉的質(zhì)量濃度或其固有屬性如分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)掩味劑主要有阻斷味蕾，增甜，混淆大腦對(duì)苦味感官等抑制苦味的原理，銀杏葉溶于水后比較黏，有些物質(zhì)可能吸附在傳感器上，減少了苦味物質(zhì)與傳感器的接觸，影響了電勢(shì)，或者與電子舌本身性質(zhì)也有關(guān)系。綜上所述，電子舌仍需進(jìn)行優(yōu)化和改進(jìn)，才能更好地應(yīng)用于評(píng)價(jià)藥物的掩味效果，單獨(dú)使用電子舌對(duì)類(lèi)似的制劑進(jìn)行處方篩選，發(fā)揮其客觀、快速、穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)的優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)電子舌和口嘗法兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，且得到的結(jié)果也都具有參考意義，口嘗法能夠利用得到的數(shù)據(jù)擬合出方程和曲線，方便我們對(duì)掩味劑的濃度對(duì)其掩味效果進(jìn)行預(yù)測(cè)，而電子舌得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與口嘗法的結(jié)果也有相似之處，但局限于特定的載體和特定的味覺(jué)傳感器，本實(shí)驗(yàn)揭示了4種掩味劑抑制銀杏葉苦味的規(guī)律，對(duì)中藥的掩味研究具有一定的參考意義，然而中藥的苦味成分非常復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法仍需要進(jìn)一步研究。