頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率的影響

王玲，袁麗，鄭林，鞏仔鵬，李月婷，潘潔，黃勇*（.貴州醫(yī)科大學貴州省藥物制劑重點實驗室/藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550004；.貴州醫(yī)科大學民族藥與中藥開發(fā)應用教育部工程研究中心，貴陽 550004）

左氧氟沙星作為喹諾酮類廣譜抗菌藥物，在臨床上廣泛用于治療泌尿生殖系統(tǒng)感染、呼吸道感染和皮膚軟組織感染等[1]，在治療尿路感染方面療效尤為顯著。頭花蓼（Polygonum capitatum）是一種貴州苗族習用藥材，具有清熱利濕、利尿通淋、解毒止痛等功效[2]。臨床上頭花蓼提取物制成的單方制劑熱淋清顆粒與左氧氟沙星聯用十分廣泛，聯合使用可提高療效，縮短療程，減少抗菌藥物的不良反應[3-5]。盡管兩者聯合應用的臨床療效評價研究較多，但尚未見國內外文獻有關于頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率影響方面的研究報道。藥物血漿蛋白結合率是藥代動力學的重要參數之一，血漿蛋白結合率的變化可引起藥物血藥濃度的變化，從而改變其藥代動力學行為，在臨床聯合用藥方面有重要意義[6]。

中藥的成分復雜，絕大多數情況是吸收入血的成分才可以發(fā)揮其療效，其中各成分不僅與化學藥產生相互作用，成分間也會相互競爭蛋白結合位點。因此，本文采用連續(xù)灌胃大鼠頭花蓼提取物后的含藥血漿與左氧氟沙星，同時，基于2×2析因設計，以左氧氟沙星的濃度和作用方式為考察因素，研究兩個因素的主效應以及其交互作用[7]，可更真實客觀地了解兩藥聯用后在體內與血漿蛋白結合的過程。本文將采用平衡透析法結合UPLC-MS/MS法對左氧氟沙星與大鼠血漿蛋白的結合進行測定，探討頭花蓼提取物對左氧氟沙星蛋白結合率的總體影響，為進一步研究兩者在臨床聯合用藥的安全合理性及藥代動力學特征提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀，TQ-D三重四極桿質譜儀（包括自動進樣器、二元梯度泵、柱溫箱、真空脫氣機、Masslynx 4.1質譜工作站，美國沃特世公司）；高速離心機（Allegra X-30 R，美國貝克曼公司）；超聲波清洗器（KQ-300DE，昆山市超聲儀器有限公司）；氮氣吹干儀裝置（MTN-2800D，天津奧特塞恩斯儀器有限公司）；多管渦旋振蕩器（VX-Ⅲ，北京踏錦科技有限公司）；萬分之一電子天平（EL204，上海METTLER TOLEDO公司）；實驗室專用超純水機（WP-UP-III-20，四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）；微量移液器（德國eppendorf股份公司）；低溫冰箱（BD-328WL，海爾集團公司）；透析袋MD-25kD（截留相對分子量8000～14 000，塞蘭博生物制品有限公司）。

1.2 試藥

頭花蓼提取物[參照《中國藥典》[8]熱淋清顆粒的提取方式提取，出膏率：9.32%，沒食子酸含量：42.06 mg·g－1）]；左氧氟沙星對照品（批號：130455-201607，純度：97.3%）、葛根素對照品（批號：110752-201512，純度：95.4%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲酸、甲醇（色譜純，德國默克公司）；純凈水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 動物

SPF級SD大鼠，雌雄各半，體質量為（230±10）g [長沙天勤生物技術有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0014]。飼養(yǎng)條件：動物房照明充足（12/12 h光/暗周期調節(jié)），空調通風良好，相對濕度（50±10）%，室溫（22±2）℃，定期對實驗室進行消毒。

2 方法

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液和內標的配制

① 精密稱取左氧氟沙星適量，用甲醇定容至10 mL，即得左氧氟沙星對照品（1.002 mg·mL－1）的儲備液，置－20℃保存，備用。

② 精密稱取葛根素（4.722 mg），用50%甲醇定容至10 mL，即得葛根素（0.4722 mg·mL－1）的儲備液。取內標葛根素儲備液適量至100 mL量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，配制成1μg·mL－1的內標溶液，置－20℃保存，備用。

2.1.2 磷酸緩沖液（PBS）的配制 精密稱取KH2PO40.2 g，Na2HPO42.88 g，KCl 0.2 g，NaCl 8.0 g，用適量超純水溶解，加1% NaOH調節(jié)pH 7.4，將溶液轉移至1000 mL量瓶中，超純水定容至刻度，即得0.01 mol·L－1PBS溶液，儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7μm）柱；保護柱：Waters Van Guard BEH C18（2.1 mm×5 mm，1.7 μm）柱；柱溫：45℃，進樣器溫度：25℃；流速：0.30 mL·min－1，進樣體積：1μL；流動相：0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），梯度洗脫（0～0.3 min，10%A；0.3～1.5 min，10%～40%A；1.5～3 min，40%～90%A；3～3.2 min，90%A；3.2～4.0 min，90%～10%A）。

2.3 質譜條件

采用電噴霧電離源（ESI）；正離子模式掃描；毛細管電離電壓：3 kV；離子源溫度：120℃；噴霧氣與反吹氣：N2；去溶劑氣流速：650 L·h－1，去溶劑氣溫度：350℃；掃描方式為多反應離子監(jiān)測（MRM），質譜數據采集及處理軟件為Masslynx 4.1質譜工作站。左氧氟沙星及內標用于定量分析的監(jiān)測離子見表1。

表1 左氧氟沙星及內標的質譜條件Tab 1 Mass spectrometry conditions for the levofloxacin and internal standards

2.4 樣品處理方法

精密量取血漿樣品（透析內液）和緩沖液（透析外液）各100 μL，置1.5 mL EP管中，加入2%甲酸水50 μL，渦旋混勻（1 min），加入50 μL葛根素內標溶液（1 μg·mL－1），再加入甲醇400 μL，渦旋混勻（1 min），超聲10 min，離心（12 000 r·min－1、4℃，10 min），取上清液置EP管中，37℃ N2吹干，150 μL 50%甲醇復溶，渦旋混勻1 min，超聲10 min，離心（12 000 r·min－1、4℃，10 min），取上清液進樣分析。

2.5 統(tǒng)計學分析

實驗數據采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，各因素間交互作用采用析因設計方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.6 方法學考察

2.6.1 專屬性 取100 μL大鼠空白血漿（不加內標）、加入對照品和葛根素的血漿、大鼠給藥后的血漿，按“2.4”項下方法操作，進樣記錄各血漿樣品色譜圖，考察方法專屬性。

2.6.2 標準曲線的制備和LLOQ 取左氧氟沙星對照品儲備液適量，分別加入空白血漿和空白緩沖液，得到在血漿中質量濃度為1.002、2.505、5.010、10.020、20.040、25.050、30.060 μg·mL－1的對照品溶液，在緩沖液中的質量濃 度 為1.002、2.505、5.010、10.020、20.040、25.050 μg·mL－1的對照品溶液。按“2.4”項下方法操作，以待測成分與相應葛根素內標峰面積之比（A/Ai）為縱坐標y，各物質濃度（C）為橫坐標x進行線性回歸，即得標準曲線。左氧氟沙星的定量下限（LLOQ）定義為S/N＝10。

2.6.3 準確度和精密度 分別配制左氧氟沙星大鼠血漿低、中、高（2.505、10.020、25.050 μg·mL－1）和緩沖液低、中、高（2.505、10.020、20.040 μg·mL－1）三種質量濃度的質控（QC）樣品，各濃度平行5份，按“2.4”項下方法處理，日內連續(xù)進樣，連續(xù)測定3 d，計算日內和日間精密度。同法平行配制低、中、高三個濃度的QC樣品5份，將測得峰面積代入隨行標準曲線計算左氧氟沙星的實際濃度，以實際測得左氧氟沙星的濃度與加入時左氧氟沙星濃度之比計算準確度。

2.6.4 提取回收率和基質效應 取100 μL大鼠空白血漿和緩沖液，按“2.6.3”項下方法分別配制低、中、高三個濃度的QC樣品，每種濃度平行配制5份，按“2.4”項下操作（A樣品）；另取100 μL空白血漿和緩沖液，除不加左氧氟沙星對照品溶液外，其他按“2.4”項下方法操作，向離心后獲得的上清液中加入相應低、中、高三種濃度的左氧氟沙星對照品溶液和內標葛根素，37℃N2吹干，殘留物以50%甲醇150 μL溶解（B樣品）；另取上述低、中、高三種濃度的左氧氟沙星對照品溶液與內標葛根素，37℃ N2吹干，殘留物以50%甲醇150 μL溶解（C樣品）。以A樣品與B樣品得到的色譜峰面積之比計算提取回收率，以B樣品與C樣品得到的色譜峰面積之比計算基質效應。

2.6.5 樣品穩(wěn)定性 按“2.6.3”項下方法配制左氧氟沙星的空白血漿和緩沖液低、中、高三個濃度QC樣品，考察樣品處理后分別置于室溫6 h（約20℃）中，4℃下冷藏12 h，反復凍融3次三種條件下的穩(wěn)定性。重復5樣本分析。

2.7 析因實驗設計

采用2×2析因實驗設計，A因素（濃度）和B因素（作用方式）各選擇2個水平：A1（3 μg·mL－1）、A2（6 μg·mL－1），B1（左氧氟沙星）、B2（頭花蓼提取物預處理），共4個組，每組重復6次，實驗方案見表2。

表2 2×2析因設計及實驗方案Tab 2 2×2 factor design and experiment plan

2.8 血漿蛋白結合率測定

將大鼠分為兩組：左氧氟沙星組（股動脈取空白血）及頭花蓼提取物預處理組[連續(xù)給予大鼠頭花蓼提取物（1.86 g·kg－1，參照前期藥代動力學實驗研究[9]的劑量）3 d]，一天兩次，末次給藥2 h后股動脈取血。

參照文獻[10]，將透析袋進行預處理，處理后的透析袋一端折疊用線結扎。按照析因實驗分組，取1 mL空白血漿（左氧氟沙星組）或取1 mL灌胃頭花蓼提取物的血漿（頭花蓼提取物預處理組）加入透析袋內，透析袋內留一小空氣泡，將透析袋另一端扎緊，使其懸浮于盛有20 mL緩沖液的廣口瓶中，膜外緩沖液左氧氟沙星質量濃度分別為3 μg·mL－1、6 μg·mL－1，調節(jié)透析袋內外液面，使其保持在同一水平面，并避免透析袋貼于瓶壁。將瓶口密封后，于4℃靜置48 h至藥物擴散平衡。透析結束后，用10%的高氯酸溶液檢查透析外液是否有蛋白漏出，有漏出者則該樣品作廢。分別測定透析袋內藥物濃度Dt（總濃度）與袋外藥物濃度Df（游離藥物濃度），根據公式計算血漿蛋白結合率：血漿蛋白結合率（%）＝（Dt－Df）/Dt×100%。

3 結果

3.1 方法學考察結果

3.1.1 專屬性 空白血漿、空白血漿＋左氧氟沙星對照品＋內標葛根素、大鼠給藥后血漿色譜圖見圖1，表明血漿中內源性物質不干擾各個成分的測定。

圖1 典型UPLC-MS/MS色譜圖Fig 1 Typical UPLC-MS/MS chromatograms

3.1.2 線性關系及定量下限 大鼠血漿和緩沖液中左氧氟沙星在相應的質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系（見表3）。

表3 血漿和緩沖液中左氧氟沙星的標準曲線和線性范圍Tab 3 Standard curve and linearity of levofloxacin in plasma and buffer

3.1.3 準確度和精密度 左氧氟沙星在大鼠血漿和緩沖液中的日內精密度和日間精密度RSD均小于15%，準確度為89.12%～ 106.16%，提示該方法準確、可靠、重現性好，符合生物樣品分析方法要求（見表4）。

表4 左氧氟沙星在大鼠血漿及緩沖液中的準確度、日內和日間精密度(±s，n＝5)Tab 4 Accuracy of levofloxacin in the rat plasma and the buffer，intra-day and inter-day precision (±s，n＝5)

表4 左氧氟沙星在大鼠血漿及緩沖液中的準確度、日內和日間精密度(±s，n＝5)Tab 4 Accuracy of levofloxacin in the rat plasma and the buffer，intra-day and inter-day precision (±s，n＝5)

樣品 QC樣品濃度/（μg·mL－1）日內日間濃度/（μg·mL－1）精密度（RSD）/% 準確度/% 濃度/（μg·mL－1） 精密度（RSD）/% 準確度/%緩沖液 2.505 2.36±0.10 4.1 94.39 2.65±0.17 6.6 106.16 10.020 8.91±0.48 5.4 89.12 9.16±0.28 3.0 91.61 20.040 18.84±1.74 9.2 94.21 20.82±1.24 6.0 104.12血漿 2.505 2.44±0.15 6.1 97.43 2.33±0.22 9.5 93.02 10.020 8.99±0.75 8.3 89.87 9.41±0.71 7.6 94.15 25.050 23.39±1.11 4.7 93.58 24.34±1.25 5.2 97.34

3.1.4 提取回收率和基質效應 低、中、高三個濃度下左氧氟沙星提取回收率在91.11%～105.42%，基質效應在87.99%～ 103.97%，RSD均小于15%。結果表明該方法提取回收率良好，不存在明顯的基質效應，均滿足生物樣品分析方法要求（見表5）。

表5 左氧氟沙星在大鼠血漿及緩沖液中的提取回收率和基質效應(±s，n＝5)Tab 5 Extraction recovery and matrix effect of levofloxacin in the rat plasma and the buffer (±s，n＝5)

表5 左氧氟沙星在大鼠血漿及緩沖液中的提取回收率和基質效應(±s，n＝5)Tab 5 Extraction recovery and matrix effect of levofloxacin in the rat plasma and the buffer (±s，n＝5)

樣品 QC樣品濃度/（μg·mL－1）提取回收率 基質效應濃度 RSD/% 濃度 RSD/%緩沖液 2.505 91.11±3.19 3.5 87.99±2.46 2.8 10.020 93.28±3.02 3.2 90.37±4.58 5.1 20.040 105.42±5.80 5.5 103.97±5.46 5.3血漿 2.505 95.27±9.74 10.2 101.82±6.35 6.2 10.020 103.69±6.13 5.9 96.46±4.70 4.9 25.050 94.19±6.25 6.6 89.10±4.38 4.9

3.1.5 樣品穩(wěn)定性 左氧氟沙星血漿和緩沖液樣品在室溫6 h、冷藏12 h和反復凍融3次均比較穩(wěn)定，滿足生物樣品分析方法要求（見表6）。

表6 左氧氟沙星在大鼠血漿和緩沖液中的穩(wěn)定性(±s，n＝5)Tab 6 Stability of levofloxacin in the rat plasma and the buffer (±s，n＝5)

表6 左氧氟沙星在大鼠血漿和緩沖液中的穩(wěn)定性(±s，n＝5)Tab 6 Stability of levofloxacin in the rat plasma and the buffer (±s，n＝5)

?次樣品 QC樣品濃度/（μg·mL－1）室溫6 h 冷藏12 h 反復凍融3濃度/（μg·mL－1） 準確度/% 濃度/（μg·mL－1） 準確度/% 濃度/（μg·mL－1） 準確度/%緩沖液 2.505 2.37±0.21 94.61 2.64±0.23 105.39 2.30±0.21 91.82 10.020 9.70±0.85 96.81 9.23±1.17 92.12 8.80±0.32 87.82 20.040 21.16±2.29 105.59 19.60±1.79 97.80 19.08±1.33 95.21血漿 2.505 2.33±0.22 93.01 2.44±0.32 97.41 2.36±0.24 94.21 10.020 9.41±0.71 93.91 9.50±1.02 94.81 10.44±1.04 104.19 25.050 23.09±1.11 92.18 23.87±2.10 95.20 25.60±0.87 102.20

3.2 頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率的影響

左氧氟沙星在3 μg·mL－1、6 μg·mL－1下，灌胃頭花蓼提取物后，與單用左氧氟沙星組相比，聯用組左氧氟沙星的血漿蛋白結合率均顯著增加（P＜0.05）。隨著左氧氟沙星濃度增加，其蛋白結合率均降低（見表7）。析因方差分析結果見表8，各因素對左氧氟沙星的蛋白結合率的影響大小為：FB＞FA＞F（A*B），表明作用方式因素對左氧氟沙星的蛋白結合率影響大于濃度因素。

表7 頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率的影響(±s，n＝6)Tab 7 Effect of Polygonum capitatum extract on the plasma protein binding rate of levofloxacin (±s，n＝6)

表7 頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率的影響(±s，n＝6)Tab 7 Effect of Polygonum capitatum extract on the plasma protein binding rate of levofloxacin (±s，n＝6)

注（Note）：與單用組相比，*P＜0.05（Compared with the single group，*P＜0.05）。

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表8 主效應及交互作用分析結果Tab 8 Main effect and interaction analysis

4 討論

目前，已報道的關于研究藥物血漿蛋白結合率的方法，主要包括平衡透析法、超濾法、超速離心法、凝膠過濾法等[11]，其中平衡透析法具有操作簡單、經濟、受實驗因素干擾小等優(yōu)點[12]，故采用最為經典的方法來測定血漿蛋白結合率。據文獻報道，血漿蛋白分子量為69 kD，考慮到血漿中大量內源性物質透析到袋外，可能對血漿蛋白的結合能力有影響，因此本實驗采用截留分子量為 8000～14 000的25 kD透析袋進行實驗，效果良好[13]。利用平衡透析法測定蛋白結合率最經典的方法是在透析袋內加入空白血漿，外液放入含藥PBS溶液，而本文首次將頭花蓼提取物多次灌胃后取其血漿研究對左氧氟沙星蛋白結合率的影響。中藥具有“多成分、多環(huán)節(jié)、多途徑、多靶點”的作用特點，因此，灌胃后取其血漿更能真實地反映頭花蓼口服進入胃腸道后吸收入血的過程，再用體外實驗進行蛋白結合率的研究，更能客觀反映兩藥合用后其在體內的蛋白結合情況。

本實驗采用UPLC-MS/MS技術結合平衡透析法測定左氧氟沙星的蛋白結合率，結果表明該法可快速、準確地測定左氧氟沙星的含量。本研究采用平衡透析法，對實驗平衡時間進行了考察，在4℃條件下，平衡12、24、36、48和72 h后分別測定透析袋內外濃度，結果在平衡48 h后，左氧氟沙星與血漿蛋白結合已達到平衡，最終選擇48 h為平衡時間。同時，本課題組前期藥代動力學實驗表明，大鼠給予左氧氟沙星后Cmax為（6032.91±1960.11）ng·mL－1，因此，選擇6 μg·mL－1和3 μg·mL－1兩個濃度的左氧氟沙星進行頭花蓼提取物對左氧氟沙星蛋白結合率的影響研究[9]。析因方差分析結果表明，兩者之間不存在明顯的交互作用。其中濃度和作用方式對左氧氟沙星的蛋白結合率均有顯著影響，但尚不能認為是兩者間的交互作用對左氧氟沙星的蛋白結合率產生影響。

左氧氟沙星的血漿蛋白結合率約為20%～22%，與文獻報道血漿蛋白結合率24%～38%存在差異[14]，可能與透析膜的微量吸附有一定關系。另外，左氧氟沙星與大鼠血漿蛋白低度結合，說明其由于血漿蛋白結合率的改變而導致游離藥物濃度急劇升高所產生不良反應的可能性不大，因此，增加了與其他藥物聯用的可能性。藥物與血漿蛋白結合的變化影響血液中游離藥物濃度，導致藥物在體內的分布、代謝、排泄以及目標靶點結合的變化，從而影響藥理效應過程。本課題組前期在組織分布與排泄實驗中，頭花蓼提取物和左氧氟沙星合用后左氧氟沙星在各組織中含量顯著降低，尿累積排泄率從20.69%下降到11.84%，糞便累積排泄率從26.08%下降到13.28%[15]。本研究結果表明聯合應用頭花蓼提取物后左氧氟沙星的蛋白結合率顯著增加（P＜0.05），藥物從血液進入各組織和器官中的藥量減少，影響藥物在體內的分布和排泄過程，這與前期實驗研究結果基本一致。臨床研究報道將頭花蓼提取物與左氧氟沙星聯用來提高其治療泌尿系統(tǒng)感染的療效，目前，在藥代動力學水平上的研究無法強有力地解釋這個問題。藥物相互作用可分為藥代動力學相互作用和藥效學相互作用。在藥效學層面，藥物如何使機體發(fā)揮作用，其作用機制是全面而復雜的，推測可能是由于兩種藥物對病原菌的協同抑制作用[16-17]，降低細菌在尿路上皮細胞中的黏附能力，加快致病菌排出體外，從而提高療效，但是這些推測還需要進一步的實驗來證實。因此，通過頭花蓼提取物對左氧氟沙星血漿蛋白結合率影響的研究，可為兩者臨床合理用藥體內過程研究提供更全面的藥代動力學參數，后期可對兩者合用的具體機制進行更深入的研究。