含氨基酸或小肽的陽離子抗菌藥物

王艷，吳條，唐美，鄒俊娜（中南大學化學化工學院，長沙 410083）

念珠性陰道炎（vulvovaginal candidiasis，VVC）是女性最困擾的疾病之一，大約75%的女性一生至少患一次念珠性陰道炎。更糟糕的是，耐藥菌株的出現會導致念珠性陰道炎治療失敗。實際上，耐藥菌的出現和迅速傳播已成為最大的公共衛生威脅之一，迫切需要研發不易誘導耐藥菌產生的新抗菌藥物。

人工設計合成的短脂肽（synthetic short lipopeptides，SSLP）[1-2]模擬天然抗菌肽（antimicrobial peptides，AMP）兩親性的結構特征，帶有凈正電荷和疏水團，保留了AMP的抗菌活性[3-5]，不同的是，SSLP的肽鏈很短，典型的SSLP肽鏈只有2～5個氨基酸殘基，而且SSLP的疏水團是脂肪酸鏈部分，一般為10～18個碳原子，這不僅彌補了肽鏈短的問題，還提高了抗菌活性，同時SSLP的結構簡單，可以實現工業化生產，克服了天然AMP來源有限和價格昂貴的問題，近年來獲得大量關注。很多研究表明SSLP與AMP相似，主要通過破壞膜結構發揮殺菌作用，且抑菌活性依賴于正電荷數與碳鏈長度的平衡[6-8]。

陽離子表面活性劑（cationic surfactant，CS）具有SSLP相似的結構特征和抗菌活性，包括經典陽離子表面活性劑（classical cationic surfactant，CCS）（如苯扎溴銨、醋酸氯己定[9]）和氨基酸基陽離子表面活性劑（amino acid-based cationic surfactant，AACS）（如Nα-酰基精氨酸乙酯[10]）。AACS是SSLP的結構類似物，SSLP的肽鏈縮短到只有一個氨基酸就成為AACS，AACS的結構更加簡單，合成更容易，更具優勢。

本文研究的SSLP包括四種脂二肽[棕櫚酰精氨酰精氨酰胺（C16-RR-NH2）、棕櫚酰賴氨酰賴氨酰胺（C16-KK-NH2）、棕櫚酰精氨酰賴氨酰胺（C16-RK-NH2）、棕櫚酰賴氨酰精氨酰胺（C16-KR-NH2）]和一種脂五肽[葵酰精氨酰賴氨酰色氨酰色氨酰賴氨酰胺（C10-RKWWK-NH2）]，AACS包括六種不同碳氫鏈長的Nα-酰基精氨酸乙酯[Nα-癸酰精氨酸乙酯（C10-R-OEt）、Nα-月桂酰精氨酸乙酯（C12-R-OEt）、Nα-肉豆蔻酰精氨酸乙酯（C14-R-OEt）、Nα-棕櫚酰精氨酸乙酯（C16-R-OEt）、Nα-硬脂酰精氨酸乙酯（C18-ROEt）、Nα-花生酰精氨酸乙酯（C20-R-OEt）]，作為對照的CCS包括苯扎溴銨和醋酸氯己定。

1 材料與方法

1.1 試藥

L-精氨酸鹽酸鹽（阿拉丁生物科技），葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯（薩恩化學），其他用于合成Nα-酰基精氨酸乙酯的試劑都為分析純，苯扎溴銨、醋酸氯己定（國藥集團）。C10-RKWWK-NH2、C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和 C16-KRNH2由合肥國肽生物技術公司定制合成。

1.2 Nα-酰基精氨酸乙酯的合成與表征

取10 mmolL-精氨酸鹽酸鹽加入500 mmol的乙醇中，冰浴攪拌0.5 h。使用恒壓滴液漏斗緩慢滴加50 mmol二氯亞砜，待放熱結束，常溫攪拌12 h，旋干溶劑得精氨酸乙酯鹽酸鹽。

將制得的精氨酸乙酯鹽酸鹽溶解在適量乙醇中，滴加30 mmol三乙胺，冰浴攪拌1 h。將混合液平均分為6份，分別滴加適量的葵酰氯、月桂酰氯、肉豆蔻酰氯、棕櫚酰氯、硬脂酰氯和花生酰氯，常溫攪拌12 h，旋干溶劑，得到不同酰基鏈長度的Nα-酰基精氨酸乙酯粗品。

采用飽和碳酸氫鈉洗滌-萃取-透析方法進行純化，純度經HPLC測定均大于95%，產率大于80%。1H NMR（布魯克AVANCE Ⅲ，400 MHz，DMSO-d6）表征結果：

C10-R-OEt：δ4.19（dd，J＝13.0，8.6 Hz，1H），4.12～4.03（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.65～1.55（m，1H），1.51～1.48（m，4H），1.24（s，12H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.5 Hz，3H）。

C12-R-OEt：δ4.18（dd，J＝13.0，8.4 Hz，1H），4.12～4.04（m，2H），3.08（s，2H），2.12（t，J＝7.3 Hz，2H），1.76～1.68（m，1H），1.63～1.58（m，1H），1.52～1.46（m，4H），1.24（s，16H），1.18（t，J＝7.1 Hz，3H），0.86（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C14-R-OEt：δ4.16（dd，J＝12.2，7.7 Hz，1H），4.12～3.98（m，2H），3.11（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.77～1.68（m，1H），1.63～1.54（m，1H），1.51～1.46（m，4H），1.24（s，20H），1.19（t，J＝7.3 Hz，3H），0.86（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C16-R-OEt：δ4.17（dd，J＝12.6，7.6 Hz，1H），4.09～4.04（m，2H），3.09（s，2H），2.12（t，J＝7.4 Hz，2H），1.73～1.67（m，1H），1.63～1.59（m，1H），1.52～1.47（m，4H），1.23（s，24H），1.17（t，J＝7.2 Hz，3H），0.85（t，J＝6.4 Hz，3H）。

C18-R-OEt：δ4.18（dd，J＝12.9，7.8 Hz，1H），4.11～4.05（m，2H），3.10（s，2H），2.12（t，J＝7.2 Hz，2H），1.75～1.67（m，1H），1.65～1.57（m，1H），1.54～1.44（m，4H），1.24（s，28H），1.17（t，J＝7.0 Hz，3H），0.85（t，J＝6.2 Hz，3H）。

C20-R-OEt：δ4.19（dd，J＝12.7，7.6 Hz，1H），4.10～4.04（m，2H），3.07（s，2H），2.11（t，J＝7.2 Hz，2H），1.74～1.67（m，1H），1.63～1.56（m，1H），1.49～1.47（m，4H），1.23（s，32H），1.17（t，J＝7.1 Hz，3H），0.85（t，J＝6.1 Hz，3H）。

1.3 菌株、細胞和培養條件

大腸埃希菌（E.coli，ATCC25922）、金黃色葡萄球菌（S.aureus，ATCC25923）、白假絲酵母菌（C.albicans，ATCC10231）、銅綠假單胞菌（P.aeruginos，ATCC27853）、耐甲氧西林金黃葡萄球菌（MRSA，ATCC43300）購自廣東省微生物保藏中心，卷曲乳桿菌（L.crispatus，CGMCC1.2743）購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌株于－80℃保存在Microbank菌種保藏管中。C.albicans使用RPMI 1640培養基（3-嗎啉丙磺酸緩沖液調節），E.coli、S.aureus、P.aeruginos和MRSA使用CAMHB肉湯培養基，L.crispatus使用MRS肉湯培養基，37℃恒溫振蕩培養箱中孵育16～24 h，其中L.crispatus置于無氧、含5%CO2的條件下孵育。人陰道上皮細胞株VK2/E6E7（上海栩冉生物科技有限公司）采用添加有10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培養基（含谷氨酰胺）。

1.4 抑菌活性、溶血活性、細胞毒性和誘導耐藥實驗

采用微量肉湯稀釋法測定最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MMC），按美國臨床實驗室標準化協會推薦的用于抗微生物制劑的標準方案進行。殺菌動力學由時間殺菌實驗測定[11]，使用新鮮無菌脫纖維羊血進行藥物溶血活性實驗[12]，藥物對于人陰道上皮細胞株VK2/E6E7的毒性采用MTT法，按文獻方法測定細胞死亡率[13]。

1.5 藥物穩定性實驗

采用加速實驗法研究藥物的穩定性，配制一系列不同pH值（pH 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）的C12-R-OEt水溶液（0.05%），每一種pH值的樣品均分為兩份，放入兩個容器中密封，其中一個作為對照樣，冷藏保存；另一個于95℃水浴中加熱1 h，然后自然冷卻至室溫，與對照樣一起進行HPLC檢測，計算相對含量（C）。

采用t0.9法（藥物分解10%的時間）測定藥物的理論有效期[14]：5份C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0的0.1 mol·L－1醋酸鈉緩沖溶液）分別放在5個恒溫水浴中加速分解，對照樣冷藏保存，分別在兩個時間點取樣（60℃，2.5 h，3 h）、（65℃，2.0 h，2.5 h）、（70℃，1.5 h，2 h）、（75℃，1.0 h，1.5 h）、（80℃，0.5 h，1 h），觀察產品外觀，與對照樣一起進行HPLC檢測，計算相對含量（C）。以相對含量的對數（lgC）對時間t進行線性回歸，通過不同溫度T的擬合曲線，計算出各T的t0.9，再以各T的lgt0.9對（1/T）進行線性擬合，即可計算出任意溫度下藥物的理論有效期。

采用Agilent 1260高效液相色譜儀，Agilent SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）色 譜 柱，流動相A為0.01%三氟乙酸水溶液，流動相B為0.01%三氟乙酸乙腈溶液，洗脫梯度（0～15 min，20%～85%B；15～17 min，85%B；17～20 min，85%～20%B），流速1.0 mL·min－1，檢測波長215 nm，柱溫30℃，進樣量20 μL。

1.6 多次陰道刺激性實驗

委托有資質的機構（蘇州出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫綜合技術中心）進行家兔多次陰道黏膜刺激實驗，依據《消毒技術規范》（2002年版）[15]，受試物為C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），對照組為0.9%氯化鈉注射液，報告編號為HWY201800750。

2 結果與討論

2.1 抗菌活性

2.1.1 抗菌敏感性實驗 表1列出了本文研究的AACS、SSLP以及作為對照的CCS對三種標準菌株（革蘭氏陰性菌E.coli、革蘭氏陽性菌S.aureus和真菌C.albicans）的MIC和MMC，及對L.crispatus的MIC和MMC，并計算出選擇性系數（SR），SR定義為L.crispatus和C.albicans MIC的比值（MICL.c./MICC.a.），SR越大意味著相對于陰道正常菌群，藥物對于真菌有更好的選擇性抑制作用。從表1可見，除了C20-R-OEt 對于真菌的MIC和MMC＞256 μg·mL－1之外，其他藥物對于這三種標準菌株的MIC為4～256 μg·mL－1，MMC為1×MIC或者2×MIC，都顯示出良好的殺菌活性。

表1 測試藥物的抗菌活性和對真菌的選擇性(μg·mL－1)Tab 1 Antimicrobial activity and fungal selectivity of the test drug (μg·mL－1)

具體來說，兩種SSLP顯示出中等的殺菌活性（脂二肽MIC在16～64 μg·mL－1，脂五肽MIC在8～32 μg·mL－1，SR＝8）。文獻報道富含精氨酸（R）和色氨酸（W）的多肽和脂肽具有最高的抗菌活性，并推薦脂五肽C10-RKWWKNH2作為很有潛力的抗菌藥物[7]。但是本研究表明，這種脂五肽并沒有顯示出比別的測試藥物更好的抗菌活性和更高的真菌選擇性。四種脂二肽（C16-RR-NH2、C16-KK-NH2、C16-RK-NH2和C16-KR-NH2）的MIC、MMC和SR都相差不大，說明精氨酸和賴氨酸的不同組合及順序對抗菌活性沒有什么影響。兩種CCS（苯扎溴銨和醋酸氯己定）都有較好的抗菌能力（MIC在4～16 μg·mL－1，SR在8～16）。需要指出的是，Nα-酰基精氨酸乙酯抗菌活性隨酰基的碳氫鏈長的增加表現出鐘形曲線的變化趨勢，與SSLP和CCS相較而言，C12-R-OEt和C14-R-OEt對于細菌（E.coli和S.aureus）具有更好的抗菌活性（MIC在8～16 μg·mL－1，SR＝16），C16-R-OEt和C18-R-OEt對于真菌C.albicans具有更好的抗菌活性（MIC＝4 μg·mL－1，SR＝16）。

2.1.2 殺菌動力學 從圖1殺菌速度曲線可以得出測試藥物完全殺滅三種標準菌株所需的最短時間。藥物濃度對于細菌和真菌分別設置為1×MMC和2×MMC，在這些濃度下，100%菌株會在24 h內被完全殺滅，當作用時間限制在20 min時，測試藥物表現出不同的殺菌動力學特征。C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2有最快的殺菌速度，在2～10 min內殺滅了100%的E.coli（見圖1A）和S.aureus（見圖1B），C12-R-OEt 和 C14-R-OEt 殺真菌的速度最快，2 min內就殺滅了全部的C.albicans（見圖1C）。其他測試藥物的殺菌速度都要慢一些（有些數據沒有顯示在圖1中）。圖1的結果說明，從殺滅三種標準菌株的速度來看，C12-R-OEt性能最佳，C10-RKWWK-NH2次之。

圖1 殺菌動力學Fig 1 Microbicidal kinetics

2.1.3 對于耐藥菌株的抗菌活性P.aeruginosa是一種對于很多抗菌藥物有天然耐藥性的條件致病菌，MRSA不僅對于甲氧西林耐藥，對于許多抗菌藥物也耐藥。表2是測試藥物對于這兩種耐藥菌株的MIC和MMC。除了醋酸氯己定，其他的測試藥物都能抑制和殺滅這兩種耐藥菌株（MIC在4～256 μg·mL－1，MMC在16～256 μg·mL－1），具體來說，P.aeruginosa能夠被完全殺滅，雖然需要的藥物質量濃度可能較高（MMC＝MIC在8～256 μg·mL－1），而在藥物較低質量濃度時MRSA的生長和繁殖就受到抑制（MIC在4～8 μg·mL－1），當藥物質量濃度增加，MRSA也會被完全殺滅（MMC在16～64 μg·mL－1），其中C10-RKWWK-NH2和C14-R-OEt對于這兩種耐藥菌株都表現出最強的殺菌活性。

表2 測試藥物對耐藥菌株的抗菌活性(μg·mL－1)Tab 2 Antimicrobial activity to resistant strains of the test drug(μg·mL－1)

2.2 溶血率和細胞毒性

表3列出了測試藥物對于羊血的溶血活性以及對于人陰道上皮細胞株VK2/E6E7的細胞毒性實驗結果。除C20-R-OEt（HC50＝128 μg·mL－1）外，不同酰基鏈長的Nα-酰基精氨酸乙酯的溶血活性沒有太大差異（HC50＝30～48 μg·mL－1），而兩種SSLP之間以及兩種CCA之間則相差較大。細胞毒性方面，Nα-酰基精氨酸乙酯的細胞毒性隨酰基的碳氫鏈長增加而增大（IC50從C12-R-OEt的66 μg·mL－1減 小 到C20-R-OEt的1.2 μg·mL－1）；兩種SSLP疏水的碳氫鏈長不同，細胞毒性也是隨著碳氫鏈長增加而增大；兩種CCA細胞毒性都較大（IC50為6.5和7 μg·mL－1）。很明顯，藥物對于紅細胞和人陰道上皮細胞的毒性不一樣，用溶血活性來評估SSLP對于哺乳動物細胞的毒性[3，7，16]是不充分的，本文的結果說明，作為一種簡化的體外藥物安全性評估手段，細胞毒性實驗不能僅用紅細胞，還應該根據給藥途徑，使用相應組織細胞來進行。

表3中還列出了針對真菌C.albicans的治療指數（HC50/MICC.a.和IC50/MICC.a），從這兩個指標綜合來看，最安全的藥物是 C12-R-OEt（HC50/MICC.a.＝6，IC50/MICC.a.＝8.5），其他藥物安全性都相對較差。值得指出的是，C10-RKWWKNH2和醋酸氯己定，從溶血活性的角度來看比較安全（HC50/MICC.a.在8～16），但是從對VK2/E6E7的細胞毒性角度來看，安全性較差（IC50/MICC.a在0.8～2.3）。

表3 測試藥物對綿羊紅細胞和人陰道上皮細胞株VK2/E6E7的細胞毒性(μg·mL－1)Tab 3 Toxicity to ovine erythrocytes and human vaginal epithelial cells VK2/E6E7 of the test drug (μg·mL－1)

2.3 誘導耐藥菌產生情況

綜合以上結果，我們選擇抑菌活性和安全性都較好的C12-R-OEt繼續進行研究，同時以C10-RKWWK-NH2和醋酸氯己定為對照，通過30 d連續給藥，每日測定MIC（見圖2）。從圖2C可以 看 出，C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2對 于C.albicans的MIC變化很小，30 d內MIC只增加了一倍（C12-R-OEt的MIC從4 μg·mL－1變為8 μg·mL－1，C10-RKWWK-NH2的MIC從16 μg·mL－1變為32 μg·mL－1），而醋酸氯己定的MIC變化很大，30 d內MIC增加了7倍（MIC從8 μg·mL－1變 為64 μg·mL－1）。C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2對 于E.coli（見 圖2A）和S.aureus（見圖2B）的MIC呈現相同的變化趨勢，說明同為氨基酸基陽離子兩親性化合物，不易誘導耐藥菌產生。有研究認為帶正電荷的AMP和SSLP通過靜電作用力結合到帶負電荷的微生物細胞膜上，導致膜結構破壞而死亡[1，17]，本研究推測C12-R-OEt具有同樣的作用機制。雖然多黏菌素也有類似的機制，且近些年多黏菌素的耐藥率有增加趨勢，但是多黏菌素對革蘭氏陰性細菌作用仍然頗強[18]，而從表1的結果來看，本文的測試藥物對于革蘭氏陽性菌和陰性菌的活性相當，說明包括C12-R-OEt在內的測試藥物與多黏菌素的抗菌作用機制有所不同，具體作用機制有待研究。

需要指出的是，雖然醋酸氯己定對兩種耐藥菌株有很好的抗菌活性（MIC＝4～8 μg·mL－1，MMC＝8～32 μg·mL－1），但是考慮到其對人陰道上皮細胞株VK2/E6E7細胞毒性較大（IC50/MICC.a.＝0.8），且誘導耐藥菌產生的傾向較大（見圖2），不適合作為念珠性陰道炎外用治療藥物。

圖2 誘導耐藥試驗Fig 2 Serial passage experiments for resistance induction

本文還做了交叉耐藥實驗，取醋酸氯己定連續給藥30 d后，MIC已經增大7倍的菌株，轉而給 藥C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2，結果發現MIC與各自的初試值相同，說明對醋酸氯己定已經開始產生耐藥的菌株，仍然對C12-R-OEt 和C10-RKWWK-NH2敏感，說明C12-R-OEt和C10-RKWWK-NH2的抑菌機制可能與CCS不同。

2.4 穩定性

加速實驗法測定了不同pH條件下 C12-ROEt水溶液的穩定性，以C10-RKWWK-NH2為對照，95℃ 加熱 1 h 后，C12-R-OEt含量隨pH變化呈鐘形變化趨勢，pH較低或較高時（pH 1～2和pH 7～9），C12-R-OEt的含量顯著降低（超過15%），當pH為3～6特別是pH為 3～4時，C12-R-OEt含量基本沒有變化（回收率超過98%），C10-RKWWK-NH2水溶液比較穩定（pH 4時回收率為96%，pH 7時回收率為98%），并且水溶液的外觀均無變化。然而當以固體形式于4℃儲存12個月后，C12-R-OEt固體與初試狀態無異，C10-RKWWK-NH2已經潮解，顏色也從白色變成棕黃色，說明C10-RKWWK-NH2穩定性較差。原因可能是其富含色氨酸，色氨酸是一種不穩定的氨基酸，在多肽鏈中容易分解著色，說明從化學穩定性角度，設計開發SSLP作為臨床抗菌藥物時應避免使用色氨酸，即便富含色氨酸的脂肽抗菌活性較好[7]。

通過以上加速實驗法確定將C12-R-OEt配制成pH 4的水溶液使用（0.05%，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），與陰道的pH環境基本一致。通過t0.9法預測其保質期，首先以相對含量的對數（lgC）對時間t進行線性回歸，根據線性回歸方程計算出各T的t0.9，結果見表4，以各T的lgt0.9對（1/T）進行線性擬合，得到：lgt0.9＝7185.1（1/T）－20.0（r2＝0.9923），據此計算出保質期約為1.5年（298 K），可見該溶液比較穩定，可以開發為臨床使用的洗液。

表4 不同溫度(T)時lg C 對時間(t)的線性回歸方程及t0.9 Tab 4 Linear regression equation of lg C versus (t) at different temperatures (T) and t0.9

2.5 陰道黏膜刺激實驗

根據以上研究結果，C12-R-OEt具有作為陰道抗菌洗液的潛力，故對其進行了多次家兔陰道黏膜刺激實驗。實驗組為C12-R-OEt水溶液（0.05%，pH 4.0，0.1 mol·L－1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液），對照組為0.9%氯化鈉注射液。陰道解剖觀察結果表明，實驗組3只動物中有2只出現充血，1只出現水腫，對照組3只動物中1只出現充血，未見其他異常反應。根據組織學觀察結果對陰道黏膜的刺激反應進行評分，實驗組和對照組平均計分為7.33 和 6.56，據此計算出實驗組的刺激指數為0.77，根據《消毒技術規范》[15]，刺激指數＜1為“無刺激性”，所以C12-R-OEt對家兔陰道黏膜刺激實驗結果為無刺激性。

3 結論

三種氨基酸基陽離子表面活性劑（C12-ROEt，C14-R-OEt 和C16-R-OEt）、兩種短脂肽（C10-RKWWK-NH2和C16-RK-NH2）和一種經典陽離子表面活性劑（醋酸氯己定）對于三種標準菌株（革蘭氏陰性菌E.coli、革蘭氏陽性菌S.aureus和真菌C.albicans）都有抗菌活性，對耐藥菌株（P.aeruginosa和MRSA）也有很好的抑制作用；除了醋酸氯己定，都不易誘導耐藥菌產生；C12-R-OEt具有最快的殺菌速度，C10-RKWWK-NH2次之。

短脂肽的溶血活性較小，但是對于人陰道上皮細胞株VK2/E6E7的毒性較大，所以短脂肽可以替代經典陽離子表面活性劑用于器械消毒，但是不適于作為念珠性陰道炎的候選藥劑，提示在設計抗菌脂肽時要尋找新的疏水片段代替脂肪酸鏈，如具有疏水側鏈的氨基酸。

C12-R-OEt結構簡單，容易合成，對于念珠菌敏感，不易誘導耐藥菌的產生，安全性高，穩定性好，對陰道黏膜無刺激性，最有潛力開發為念珠性陰道炎抗菌洗液。