窄治療指數(shù)藥物利伐沙班片在中國(guó)健康受試者中的生物等效性研究

王鑄輝，陽(yáng)曉燕，張行飛，陽(yáng)國(guó)平，黃潔，鄒嬋（.湖南省藥品審評(píng)與不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)中心，長(zhǎng)沙 4003；.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院臨床試驗(yàn)研究中心，長(zhǎng)沙 4003）

利伐沙班直接通過(guò)抑制凝血因子Ⅹa可中斷凝血瀑布的內(nèi)源性和外源性途徑，抑制凝血酶的產(chǎn)生和血栓形成。目前，利伐沙班是血栓栓塞性疾病推薦的一線用藥[1-5]。與華法林需頻繁監(jiān)測(cè)患者國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）相比，利伐沙班的治療依從性更好。利伐沙班于2008年在加拿大和歐盟獲得上市批準(zhǔn)，2009年在澳大利亞及中國(guó)獲批，2011年在美國(guó)獲批。本研究旨在評(píng)價(jià)南京恒生制藥有限公司生產(chǎn)的利伐沙班片與參比制劑在中國(guó)健康受試者的生物等效性及安全性，為國(guó)內(nèi)利伐沙班仿制藥上市審批提供依據(jù)。

1 材料

利伐沙班片受試制劑（T，規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)：191201，含量：101.2%，南京恒生制藥有限公司）；利伐沙班片參比制劑（R，商品名：拜瑞妥，規(guī)格：20 mg/片，批號(hào)：BJ45597，含量：101.1%，Bayer AG）；利伐沙班（對(duì)照品，純度：99.7%，批號(hào)：ITM10082849，上海陶素生化科技有限公司）；Rivaroxaban-d4（內(nèi)標(biāo)，純度：98%，批號(hào)：9-JHY-173-5，Toronto Research Chemicals）；甲醇、乙腈、甲酸（Merck 公司）；二甲亞砜（DMSO，國(guó)藥集團(tuán)）；水為超純水。HPLC30-AD超快速液相系統(tǒng)（日本Shimadzu）；AB Sciex API 5500質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 受試者選擇

入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～60周歲，男女均可；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）19.0～26.0 kg·m－2，男性受試者體質(zhì)量≥ 50.0 kg，女性受試者體質(zhì)量≥45.0 kg。試驗(yàn)前簽署知情同意書，并對(duì)試驗(yàn)內(nèi)容、過(guò)程及可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)有充分了解；志愿者能夠和研究者進(jìn)行良好的溝通，并且理解和遵守本項(xiàng)研究的各項(xiàng)要求。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患有需排除的疾病，包括但不限于心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)（包括個(gè)人或家族史遺傳性免疫缺陷）、精神病、代謝異常、惡性腫瘤、淋巴組織增生性疾病等病史且研究者認(rèn)為目前仍有臨床意義者；有食物、藥物過(guò)敏史，尤其對(duì)利伐沙班片及輔料中任何成分過(guò)敏者；有罕見(jiàn)的遺傳性半乳糖不耐受、Lapp乳糖酶缺乏癥或葡萄糖-半乳糖吸收不良（如喝牛奶腹瀉）者；既往患有任何增加出血性風(fēng)險(xiǎn)或凝血功能障礙疾病者；在服用研究藥物前3 d進(jìn)食可能影響藥物體內(nèi)代謝的食物者（包括葡萄柚或葡萄柚產(chǎn)品、火龍果、芒果、柚子、橘子等）；試驗(yàn)前1個(gè)月內(nèi)使用過(guò)任何抑制或誘導(dǎo)肝臟藥物代謝的藥物者；生命體征異常者（收縮壓＜90 mmHg或＞140 mmHg，舒張壓＜50 mmHg或＞90 mmHg；心率＜50 次·min－1或＞100 次·min－1）或體格檢查、心電圖、實(shí)驗(yàn)室檢查異常有臨床意義者（以臨床醫(yī)師判斷為準(zhǔn)）；研究者認(rèn)為依從性差或者存在不適合參加試驗(yàn)因素的受試者。

本試驗(yàn)經(jīng)中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：第20025號(hào)），所有受試者均簽署知情同意書。空腹組篩選118例，共有27例健康受試者完成試驗(yàn)，包括2例女性和25例男性，平均年齡為（25.8±5.21）歲，平均體質(zhì)量為（63.31±7.13）kg，平均BMI為（22.17±1.93）kg·m－2；餐后試驗(yàn)篩選99例，共有28例健康受試者完成試驗(yàn)，包括5例女性和23例男性，平均年齡為（24.4±5.37）歲，平均體質(zhì)量為（62.29±7.30）kg，平均BMI為（22.61±2.17）kg·m－2。

2.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按照FDA的利伐沙班片生物等效性指南，本試驗(yàn)在健康成年志愿者中進(jìn)行單中心、單劑量、隨機(jī)、開(kāi)放、兩制劑、四周期全重復(fù)交叉的生物等效性試驗(yàn)。其中空腹、餐后受試者均為 28 例，受試者按篩選號(hào)順序隨機(jī)分為兩個(gè)給藥序列組（T-R-T-R 組 /R-T-R-T 組），在四周期分別口服20 mg受試制劑T與參比制劑R，清洗期為7 d。給藥方法：空腹或者高脂餐后30 min，240 mL溫水送服。服藥前1 h及服藥后1 h內(nèi)禁止飲水，服藥前禁食至少10 h，服藥后4 h內(nèi)禁食，服藥后4、10 h統(tǒng)一進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)午餐和晚餐。分別在給藥0時(shí)（于給藥前60 min內(nèi)）和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、12、24、36、48 h采血，每次采集約4 mL。血樣采集至EDTA-K2抗凝劑中，混勻后即刻置于冰浴中暫存，1 h內(nèi)將血樣在約4℃低溫條件下離心（1700 g）約10 min，取分離后的血漿至檢測(cè)管中和備份管中，離心后的血漿樣品在采血后2 h內(nèi)置于－20℃低溫冰箱，并于每周期采血結(jié)束后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱保存，直至樣品轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.3 血漿樣本處理與測(cè)定

2.3.1 色譜條件 色譜柱：ACE 3 C18-AR（50 mm×2.1 mm，5 μm）；流動(dòng)相 A：0.4%甲酸水溶液（pH 3.2），流動(dòng)相B：0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脫（0.00～1.20 min，35%B；1.20～1.30 min，35%～100%B；1.30～1.80 min，100%B；1.80～1.90 min，100%～35%B；1.90～3.00 min，35%B）；流 速：0.6 mL·min－1；柱 溫：40℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃；進(jìn)樣量：5.00 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 正離子電噴霧離子化（ESI）；電離模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）掃描模式；離子源噴霧電壓為 5.0 kV，離子源溫度為500℃，入口電壓10 V，碰撞氣9 unit，出口電壓13 V，離子源GS1為50 psi，離子源GS2為55 psi。用于定量分析的離子反應(yīng)為利伐沙班m/z436.2 →145.0，內(nèi)標(biāo)Rivaroxaban-d4m/z440.3→145.0。

2.3.3 血漿樣品處理 精密移取樣本100 μL（空白樣品和內(nèi)標(biāo)空白樣品取100 μL空白人血漿）至96 孔板中；加入20 μL內(nèi)標(biāo)工作液，混勻；加入600 μL乙腈，加蓋96孔板蓋渦旋3 min混勻，3200 g、4℃離心5 min；取400 μL上清液至另一96孔板中，40℃氮?dú)饬鞔蹈桑患尤?00 μL復(fù)溶液[0.4%甲酸水溶液（pH3.2）∶0.1%甲酸乙腈（65∶35）]，加蓋96孔板蓋渦旋3 min，即得。

2.4 方法學(xué)考察與評(píng)價(jià)

2.4.1 特異性 取6例受試者的空白血漿，按照“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，血漿內(nèi)源性物質(zhì)的峰面積均小于利伐沙班最低定量下限（LLOQ）（1 ng·mL－1）峰面積的20%，小于內(nèi)標(biāo)峰面積的5%。結(jié)果表明，血漿內(nèi)源性物質(zhì)不干擾待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的測(cè)定，該方法的特異性良好（見(jiàn)圖1）。

圖1 血漿中分析物和內(nèi)標(biāo)的典型色譜圖Fig 1 Typical chromatogram of analyte and internal standard in plasma

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與LLOQ 配制標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品（1、2、10、50、100、250、400、500 ng·mL－1），按“2.3.3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣分析，建立利伐沙班的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以質(zhì)控樣品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，ng·mL－1），利伐沙班與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），采用加權(quán)回歸法進(jìn)行回歸，權(quán)重因子為 1/χ2。結(jié)果表明利伐沙班在1～500 ng·mL－1內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，其回歸方程為Y＝0.402X＋0.0021（R2＝0.9986），LLOQ為1 ng·mL－1。

2.4.3 精密度與回收率 配制利伐沙班LLOQ質(zhì)量濃度（1 ng·mL－1）、低質(zhì)量濃度（LQC，3 ng·mL－1）、中質(zhì)量濃度1（MQC1，20 ng·mL－1）、中質(zhì)量濃度2（MQC2，200 ng·mL－1）、高質(zhì)量濃度（HQC，375 ng·mL－1）的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度6份，重復(fù)3次，按“2.3.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，結(jié)果批內(nèi)和批間精密度（RSD）均＜5%，準(zhǔn)確度在99.4%～101.8%。用LQC、MQC2、HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度樣品，比較經(jīng)提取與未經(jīng)提取利伐沙班和內(nèi)標(biāo)的各自峰面積比值，結(jié)果低、中、高質(zhì)量濃度的平均提取回收率分別為96.34%、93.45%、92.01%，RSD分別為1.8%、0.30%、0.56%。

2.4.4 基質(zhì)效應(yīng) 取6例受試者的空白血漿，分別考察LQC、MQC2、HQC 3個(gè)質(zhì)量濃度的利伐沙班在基質(zhì)離子存在時(shí)色譜峰響應(yīng)和在基質(zhì)離子不存在時(shí)色譜峰響應(yīng)的比值。內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子為待測(cè)物的基質(zhì)效應(yīng)除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果3個(gè)質(zhì)量濃度的利伐沙班內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)因子均值分別為100%、100%和101%。

2.4.5 穩(wěn)定性 利伐沙班全血樣品在冰浴條件下放置1 h后離心，穩(wěn)定性良好；利伐沙班血漿樣品在室溫和冷藏下放置24 h、在－30～－10℃至室溫以及－90～－60℃至室溫3次凍融循環(huán)、在－30～－10℃以及－90～－60℃條件下長(zhǎng)期冰凍40 d穩(wěn)定性良好；利伐沙班血漿樣品處理過(guò)程中在1～9℃條件下放置 24 h穩(wěn)定性良好、處理后樣品1～9℃條件下放置123 h穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)計(jì)算及生物等效性判定

藥動(dòng)學(xué)參數(shù)采用非房室模型，使用Phoenix WinNonlin8.0（美國(guó)Pharsight公司）軟件和SAS 9.4進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0～t、AUC0～∞、Cmax經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行多因素方差分析（ANOVA）、雙單側(cè)t檢驗(yàn)和90%CI分析。當(dāng)受試制劑T和參比制劑R藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0～t、AUC0～∞經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后幾何均值比的90%CI均落在80.00%～125.00%，且受試制劑T和參比制劑R個(gè)體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差比值的90%CI上限≤2.5時(shí)[6]，則認(rèn)為兩制劑具有生物等效性。

2.6 血藥濃度-時(shí)間曲線

空腹組完成隨機(jī)化28例，1例受試者于第一周期給藥前退出，共有27例受試者完成試驗(yàn)。餐后組完成隨機(jī)化28例，1例受試者于第四周期給藥前退出（已完成3周期給藥盒采血），共有27例受試者全部按計(jì)劃完成試驗(yàn)。對(duì)完成血樣采集的樣本進(jìn)行血藥濃度檢測(cè)，空腹組和餐后組平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2和圖3。

圖2 空腹服用受試制劑和參比制劑的平均藥時(shí)曲線圖Fig 2 Mean plasma concentration-time curve of 27 subjects after an oral dose of rivaroxaban tablets under fasting condition

圖3 餐后服用受試制劑和參比制劑的平均藥時(shí)曲線圖Fig 3 Mean plasma concentration-time curve of 28 subjects after an oral dose of rivaroxaban tablets under fed condition

2.7 藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

空腹組27例受試者和餐后組28例受試者均納入藥動(dòng)學(xué)參數(shù)集（PKPS）分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 空腹組和餐后組受試者單次口服利伐沙班片受試制劑和參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s)Tab 1 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in both fasting and fed conditions (±s)

表1 空腹組和餐后組受試者單次口服利伐沙班片受試制劑和參比制劑的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(±s)Tab 1 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in both fasting and fed conditions (±s)

注：*表示tmax采用中位數(shù)（最小值，最大值）的形式描述。Note：*means tmax is described in terms of median（minimum，maximum）.

組別 制劑 tmax/h* Cmax/（ng·mL－1） AUC0～t /（h·ng·mL－1）AUC0～∞/（h·ng·mL－1） t1/2/h空腹組（n＝27） 受試制劑T 1.50（0.50，4.00） 195.28±46.01 1490.58±356.92 1609.00±394.74 10.12±5.88參比制劑R 2.00（0.50，4.00） 197.48±52.63 1439.72±372.20 1538.39±386.49 10.37±6.82餐后組（n＝28） 受試制劑T 2.50（1.00，4.50） 402.05±85.67 2776.66±756.91 2801.41±755.55 4.52±0.95參比制劑R 2.50（0.50，4.50） 394.42±65.29 2728.24±801.16 2760.30±805.05 4.86±1.36

2.8 生物等效性評(píng)價(jià)

受試制劑T和參比制劑R的Cmax、AUC0～t、AUC0～∞對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的幾何均數(shù)比值GMR的90%CI均落在 80.00%～125.00%，雙單側(cè)t檢驗(yàn)結(jié)果與置信區(qū)間法結(jié)果一致，受試制劑T和參比制劑R個(gè)體內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)差比值的90%CI上限≤2.5，說(shuō)明兩制劑在本實(shí)驗(yàn)空腹和餐后給藥條件下具有生物等效性[6]，詳見(jiàn)表 2、3。

表2 空腹口服受試制劑與參比制劑的主要PK參數(shù)生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 2 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in fasting condition

表3 餐后口服受試制劑與參比制劑的主要PK參數(shù)生物等效性評(píng)價(jià)結(jié)果Tab 3 Main pharmacokmetic parameters of rivaroxaban tablets of the test or the reference preparation in fed condition

2.9 安全性評(píng)價(jià)

空腹組27例受試者全部按計(jì)劃完成給藥、采血和安全性評(píng)價(jià)，并進(jìn)入安全性分析集。共有12例受試者發(fā)生17例次不良事件。服用受試制劑T期間有5例（18.5%）受試者發(fā)生了7例次不良事件，服用參比制劑R 期間有8例（29.6%）受試者共發(fā)生了10例次不良事件。不良事件為上呼吸道感染、尿白細(xì)胞酯酶陽(yáng)性、潛血陽(yáng)性、血三酰甘油升高、血尿酸升高，均為輕度不良事件，未進(jìn)行任何治療，均恢復(fù)正常。

餐后試驗(yàn) 27 例受試者全部按計(jì)劃完成給藥和采血，1例受試者完成了3個(gè)周期給藥和采血，共有28例受試者進(jìn)入安全分析集。結(jié)果15例受試者發(fā)生22例次不良事件，其中服用受試制劑T期間有8例（28.6%）受試者發(fā)生了11例次不良事件；服用參比制劑R期間有10例（35.7%）受試者發(fā)生了11例次不良事件。不良事件為上呼吸道感染、咽炎、尿白細(xì)胞陽(yáng)性、尿蛋白檢出、心率升高、血三酰甘油升高、腹瀉。有1例受試者發(fā)生中度不良事件“上呼吸道感染”，采取治療措施后恢復(fù)正常。其余均為輕度不良事件，未進(jìn)行任何治療，均恢復(fù)正常。

本試驗(yàn)研究期間兩藥安全性相近，未發(fā)生嚴(yán)重不良事件，故受試者在空腹及餐后給藥條件下口服受試制劑T和參比制劑R 20 mg后臨床安全性良好。

3 討論

利伐沙班能選擇性地阻斷Ⅹa因子的活性位點(diǎn)起到抗凝作用，其血藥濃度的微小變化可能導(dǎo)致血栓或出血，進(jìn)而危及生命，為窄治療指數(shù)藥物[1-5]。與一般化學(xué)藥物相比，窄治療指數(shù)藥物進(jìn)行生物等效性評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)采用更嚴(yán)格的等效性判定標(biāo)準(zhǔn)，以保證有效性和安全性。FDA在利伐沙班片生物等效性指南中建議，利伐沙班片的生物等效性統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)采用平均生物等效性ABE法（80%～125%），并比較受試者服用受試制劑T和參比制劑R的個(gè)體內(nèi)變異，且兩藥個(gè)體內(nèi)變異標(biāo)準(zhǔn)差比值的90%CI上限應(yīng)≤2.5[6-10]。

因此，本次研究采用四周期全重復(fù)交叉的設(shè)計(jì)，以獲得兩藥的個(gè)體內(nèi)變異。個(gè)體內(nèi)變異系數(shù)取24%，預(yù)計(jì)受試制劑與參比制劑藥代參數(shù)均值差異為10%，α＝0.05，β＝0.2（把握度1－β＝80%），利用軟件PASS 11.0進(jìn)行樣本量計(jì)算，計(jì)算結(jié)果表明納入不少于26例能夠可靠的進(jìn)行等效性判斷，考慮脫落，將樣本量定為28例。結(jié)果顯示，本次研究利伐沙班個(gè)體內(nèi)變異在14.11%～20.02%，Cmax、AUC0～t和AUC0～∞個(gè)體內(nèi)變異標(biāo)準(zhǔn)差比值的90%CI。

本次研究中，與其他文獻(xiàn)中利伐沙班等效性研究結(jié)果相似，利伐沙班在空腹組和餐后組中的部分藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（tmax、Cmax、AUC、t1/2）差異較大。餐后組中的tmax、Cmax、AUC較大，可能原因是高脂餐后給藥，會(huì)延長(zhǎng)藥物的釋放，增大藥物在體內(nèi)的吸收，從而增大藥物在體內(nèi)的暴露。在臨床治療上，該藥動(dòng)學(xué)性質(zhì)可以為劑量調(diào)整提供依據(jù)，t1/2差異較大，可能原因是餐后組PK曲線消除相采樣點(diǎn)數(shù)量較少，藥時(shí)曲線不平滑，導(dǎo)致計(jì)算出來(lái)的t1/2與空腹組相比差異較大，是本次研究的不足之處。如果在餐后組增加18 h和30 h采樣點(diǎn)，就能得到更平滑的消除相曲線。