麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜及抗氧化活性研究

張勝娜，周衡樸，劉英杰，吳素香，林潔，朱志紅*（.瑞安市中醫院，浙江 瑞安 500；.浙江中醫藥大學，杭州 400；.溫州醫科大學附屬第三醫院，浙江 瑞安 500）

麩炒枳殼為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實枳殼的炮制品，用于理氣寬中，行滯消脹等[1-3]。中藥飲片標準湯劑能作為一種標準，標化不同的臨床用藥形式，提高用藥的準確性和劑量的一致性[4-7]；中藥配方顆粒是傳統中藥飲片、湯劑的改良產品，是中藥現代化的重要成果，中藥飲片經提取研究制備成標準湯劑，然后采用不同的方法制成中藥配方顆粒，因此對中藥飲片的標準湯劑進行質量控制也是有必要的。本研究遵循標準湯劑制備要求，制備麩炒枳殼標準湯劑，采用冷凍干燥技術將其制備成標準湯劑凍干粉，計算出膏率，以柚皮苷和新橙皮苷為指標成分，測定其含量，計算轉移率，建立指紋圖譜，為建立麩炒枳殼標準湯劑的質量標準提供參考；同時進行體外抗氧化活性研究，為麩炒枳殼標準湯劑的臨床應用及麩炒枳殼配方顆粒的質量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀（美國Waters科技有限公司）；Free Zone 2.5L冷凍干燥機（美國Labconco公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；RE-3000旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；Synergy H1酶標儀（美國伯騰公司）。

1.2 試藥

柚皮苷（批號：110722-201815，純度≥98%，中國食品藥品檢定研究院），新橙皮苷（批號：200155-160801，純度≥98%，江蘇永健醫藥科技有限公司），維生素C（北京索萊寶科技有限公司，批號：20240706），DPPH自由基清除能力試劑盒、羥自由基清除能力試劑盒、總抗氧化能力試劑盒（江蘇艾迪生生物科技有限公司，批號：G20220114S），甲醇、乙腈（色譜級，美國天地有限公司），水為超純水，其他試劑為分析級。

1.3 藥材

麩炒枳殼共15批（FZK1～ FZK15），經瑞安市中醫院副主任中藥師劉英杰鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實枳殼的炮制品。經檢驗均符合《中國藥典》2020年版規定，樣品來源見表1。

表1 麩炒枳殼飲片的來源Tab 1 Source of Aurantii Fructus Praeparatus

2 方法與結果

2.1 麩炒枳殼標準湯劑凍干粉的制備及出膏率的測定

稱取15批麩炒枳殼飲片各100 g，煎煮2次。一煎加入飲片8倍量水，浸泡30 min，武火煮沸，文火保持微沸30 min。二煎加入飲片6倍量水，武火煮沸，文火保持微沸30 min。趁熱用3層紗布濾過，合并2次濾液，50℃減壓濃縮至100 mL，冷凍干燥，得標準湯劑凍干粉，計算出膏率，結果見表2。

表2 麩炒枳殼標準湯劑測定結果Tab 2 Determination of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.2 柚皮苷、新橙皮苷的測定

2.2.1 液相色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（20∶80）（用磷酸調節pH值至3）；檢測波長：283 nm；流速：1 mL·min－1；進樣量：10 μL；溫度：30℃。供試品及對照品圖譜見圖1。

圖1 枳殼標準湯劑HPLC圖譜Fig 1 HPLC chromatogram of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.2.2 對照品溶液的制備 取柚皮苷、新橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL分別含柚皮苷和新橙皮苷80.19 μg、79.08 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取麩炒枳殼凍干粉或藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱重，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液10 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.2.4 線性關系考察 精密稱取柚皮苷4.90 mg、新橙皮苷4.80 mg，用甲醇配制成含柚皮苷7.65～980.00 μg·mL－1、新橙皮苷7.50～960.00 μg·mL－1的系列對照品溶液，以峰面積（Y）對質量濃度（X，μg·mL－1）進行線性回歸。結果柚皮苷的標準曲線為：Y＝1.22×105X＋6.67×105，r＝0.9994，柚皮苷在7.65～980.00 μg·mL－1與峰面積線性關系良好；新橙皮苷的標準曲線為：Y＝1.43×105X＋1.87×105，r＝0.9994，新橙皮苷在7.50～960.00 μg·mL－1與峰面積線性關系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，按“2.2.1”項下條件進樣6次，結果柚皮苷和新橙皮苷峰面積RSD均為1.3%，說明儀器精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 取麩炒枳殼凍干粉（批號：181101）約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8、24 h后進樣測定。測得柚皮苷和新橙皮苷峰面積RSD分別為1.3%和2.2%，說明供試品溶液在24 h內穩定。

2.2.7 重復性試驗 取麩炒枳殼凍干粉（批號：181101）6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，結果柚皮苷和新橙皮苷含量RSD均為1.7%，說明該方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 精密稱取6份同一批已知柚皮苷、新橙皮苷含量的麩炒枳殼凍干粉40 mg，加入柚皮苷、新橙皮苷含量100%的對照品，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。柚皮苷和新橙皮苷平均加樣回收率分別為100.25%和100.76%，RSD分別為0.85%和0.81%，表明該方法準確可靠。

2.3 樣品的含量測定

取15批麩炒枳殼凍干粉供試品溶液進樣測定，使用外標兩點法制作隨行標準曲線，計算柚皮苷、新橙皮苷含量。進樣測定峰面積，測定15批麩炒枳殼中柚皮苷、新橙皮苷含量[1]，計算轉移率。

轉移率（%）＝凍干粉中指標成分含量/飲片中指標成分含量×100%

15批麩炒枳殼的出膏率為10.42%～16.51%；柚皮苷的含量為7.27%～12.81%，轉移率為19.04%～42.26%；新橙皮苷含量為4.98%～8.72%，轉移率為13.87%～24.19%（見表2）。

2.4 麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜的建立

2.4.1 色譜條件色譜柱：Agilent SB-C18（4.5 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～20 min，25%～40%A；20～44 min，42%～62%A；44～50 min，62%～80%A；50～60 min，80%～100%A；60～70 min，100%～25%A）；檢測波長：330 nm；流速：1 mL·min－1；進樣量：10 μL；柱溫：30℃。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液10 μL，按“2.3.1”項下條件進樣6次，測得柚皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.15%和2.4%，新橙皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.16%和2.5%，說明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取麩炒枳殼凍干粉（批號：181101）約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8、24 h后，進樣測定。結果柚皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.76%和4.1%，新橙皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.83%和4.1%，說明柚皮苷和新橙皮苷在24 h內穩定。

2.4.4 重復性試驗 取麩炒枳殼凍干粉（批號：181101）6份，每份約0.2 g，精密稱定，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，柚皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.18%和3.0%，新橙皮苷保留時間和峰面積RSD分別為0.21%和4.8%，說明該方法重復性良好。

2.4.5 指紋圖譜相似度分析 精密吸取各批供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀得指紋圖譜，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”軟件進行色譜峰匹配，找出共有峰。結果表明15批麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜中共出現12個共有峰，且分離度較好，見圖2。以FZK1為參照，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012A）軟件，分析色譜數據，計算相似度，依次為0.988、0.992、0.989、0.989、0.993、0.997、0.995、0.993、0.992、0.993、0.981、0.966、0.992、0.988、0.988，15批麩炒枳殼標準湯劑相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求（大于0.9）。

圖2 麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜Fig 2 Fingerprints of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction 6.柚皮苷（naringin）；8.新橙皮苷（neohesperidin）

2.4.6 聚類分析 將共有峰峰面積導入SPSS 26進行聚類分析，結果見圖3。15批麩炒枳殼可分為兩類：I類是FZK2、FZK3、FZK4、FZK6、FZK7、FZK11、FZK12，Ⅱ類是FZK1、FZK5、FZK8、FZK9、FZK10、FZK13、FZK14、FZK15。結果表明不同產地不同批次的麩炒枳殼存在一定差異。

圖3 麩炒枳殼標準湯劑聚類分析圖Fig 3 Cluster analysis of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction

2.4.7 主成分分析 使用SPSS 26軟件對數據標準化后進行主成分分析，設定特征值大于1，結果見表3。共篩選出3個主成分，第3個成分的累積方差貢獻率達83.831%。表明多種成分引起麩炒枳殼的質量差異，且前3個主成分能反映麩炒枳殼的基本特征。以這3個成分繪制主成分平面得分圖（見圖4），可將樣品分為兩類，與聚類分析結果一致。

圖4 主成分得分圖Fig 4 Principal component score

表3 主成分方差分析結果Tab 3 Variance analysis of principal component

2.5 體外抗氧化作用

2.5.1 供試品溶液的配制

① 麩炒枳殼標準湯劑供試品溶液：取一定量的麩炒枳殼標準湯劑凍干粉，用純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg生 藥·mL－1系列質量濃度的供試品溶液，備用。

② 麩炒枳殼藥材供試品溶液：取麩炒枳殼藥材，用80%乙醇回流提取2次，每次60 min，回收乙醇，濃縮液冷凍干燥，凍干粉用純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg生藥·mL－1系列質量濃度的供試品溶液，備用。

③ 維生素C供試品溶液：取一定量的維生素C，純水配制成1、10、50、100、500、1000、2500 μg·mL－1系列質量濃度的供試品溶液，備用。注意避光。

2.5.2 體外抗氧化試驗 按說明書中方法，以維生素C和水溶性維生素E（Trolox）為對照，進行試驗，結果見圖5。

圖5 各成分的ABTS自由基清除能力（A）、DPPH自由基清除能力（B）、總抗氧化能力（C）Fig 5 Scavenging effect of Aurantii Fructus Praeparatus standard decoction on ABTS（A），DPPH（B）and total antioxidant capacity（C）

ABTS自由基清除能力結果顯示，當質量濃度為2500 μg·mL－1時，枳殼標準湯劑ABTS自由基清除能力可達（80.42±11.93）%，稍弱于維生素C，強于枳殼藥材。說明枳殼標準湯劑和枳殼藥材具有一定的抗氧化能力，且枳殼標準湯劑＞枳殼藥材。

DPPH自由基清除能力結果顯示，當質量濃度為2500 μg·mL－1時，枳殼標準湯劑DPPH自由基清除能力可達（94.98±8.65）%，與維生素C的清除能力相當，說明枳殼標準湯劑和枳殼藥材具有良好的DPPH自由基清除能力。

總抗氧化能力結果顯示，當質量濃度為100 μg·mL－1時，維生素C的Frap值為（0.4756±0.0211），枳殼標準湯劑的Frap值為（0.1847±0.0258），枳殼藥材的Frap值為（0.1576±0.0132），說明枳殼標準湯劑和枳殼藥材有一定的總抗氧化能力。

3 討論

3.1 色譜條件的篩選

在建立麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜的過程中，考察了甲醇、乙腈、磷酸水等作為流動相以及不同流動相梯度對指紋圖譜的影響，最終確定了以甲醇-水為流動相，檢測波長為330 nm，流速為1 mL·min－1，進樣量為10 μL，柱溫為30℃，此時色譜峰數最多且分離度均較好。

3.2 標準湯劑質量控制

2020年版《中國藥典》中，枳殼的含量測定指標是柚皮苷和新橙皮苷，麩炒枳殼標準湯劑中柚皮苷和新橙皮苷的含量和轉移率均較高，體現了其質量穩定、有效成分含量高。麩炒枳殼標準湯劑指紋圖譜中特征峰超過10個，各批次麩炒枳殼圖譜相似度高，該方法適用于麩炒枳殼標準湯劑質量控制。

3.3 抗氧化作用

本試驗比較了枳殼標準湯劑和枳殼藥材的體外抗氧化活性，枳殼標準湯劑和枳殼藥材均具有一定的抗氧化能力，但測得的幾項標準湯劑抗氧化活性均強于藥材。可能是標準湯劑中多糖、苷類、蛋白質、氨基酸等水溶性成分含量較高，且這些成分均具有一定的抗氧化作用[8-9]。

3.4 小結

枳殼含有黃酮類、生物堿類等成分，柚皮苷和新橙皮苷為黃酮類的主要成分，麩炒后含量均略微下降[10]。本試驗可為麩炒枳殼飲片的質量控制和臨床應用提供依據。