基于高效液相色譜指紋圖譜及一測多評法的復方珍珠解毒口服液質量評價

謝百波，蘇加樂，里艷茹，臧新鈺，李映，尋園，周驊，程林友*（.北京慧寶源生物技術股份有限公司，北京 02206；2.廣西慧寶源醫藥科技有限公司，廣西 欽州 535008；3.抗腫瘤藥物開發國家地方聯合工程研究中心，廣西 欽州 535008）

目前，中藥指紋圖譜已廣泛應用在中藥的質量評價和控制中。指紋圖譜因模糊性、整體性的雙重特點在中藥質量控制中具有很高的應用價值。多指標成分的含量測定和“一測多評法（quantitative analysis of multi-components with single marker，QAMS）”則為中藥的整體質量研究提供了更多的選擇，此方法已被《中國藥典》收載用于多種提取物或制劑的質量控制，進一步驗證了QAMS的應用價值。因此，將指紋圖譜、多指標成分含量測定和QAMS結合起來，將更能反映藥品的整體質量。

復方珍珠解毒口服液（compound Zhenzhu Jiedu oral liquid，CPDOL）主要由珍珠層粉、地黃、土茯苓、金銀花、龜甲、甘草等6味中藥組成，具有清熱涼血、養陰解毒的作用，適用于因熱毒淤阻肌膚所致的輕型粉刺，癥見皮疹，以紅色丘疹、黑頭或白頭粉刺為主，伴有少量膿頭。復方珍珠解毒口服液藥效的發揮是多成分共同作用的結果，而現行的藥品質量標準[國家食品藥品監督管理總局WS-5267（B-0267）-2014Z]僅以金銀花中的綠原酸的含量作為質控指標，不能實現對藥品的整體質量評價，無法保證產品的質量可控性和一致性。

本研究利用HPLC法建立復方珍珠解毒口服液的指紋圖譜，同時采用QAMS測定綠原酸（金銀花）、甘草苷（甘草）、落新婦苷（土茯苓）3種有效成分的含量，為復方珍珠解毒口服液的整體質量評價和標準完善提供依據。

1 儀器和試藥

安捷倫1260 infinit Ⅱ高效液相色譜儀[安捷倫科技（中國）有限公司]、島津LC20A高效液相色譜儀[島津企業管理（中國）有限公司]、KQ-500DA型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）、RE52AA型旋轉蒸發儀（鄭州長城科工貿易有限公司）、GH-202型分析天平（A&D Company，Limited）。

乙腈、甲醇（色譜級，賽默飛世爾科技中國有限公司）；純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）。綠原酸對照品（批號：110753-201716，純度：99.3%）、甘草苷對照品（批號：111610-201607，純度：93.1%）、落新婦苷對照品（批號：111798-201504，純度：93.9%）（中國食品藥品檢定研究院）；復方珍珠解毒口服液（批號：181001、180602、180901、180902、181101、181102、181103、181201、181202、190302，廣西慧寶源醫藥科技有限公司，規格：10 mL/10支）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent 5TC-C（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.5%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，10%～20%A；10～15 min，20%～30%A；15～30 min，30%A；30～40 min，30%～10%A）；檢測波長：220 nm；流速：0.8 mL·min；進樣量：10 μL；柱溫：30℃；理論塔板數按綠原酸峰計算不低于50 000，結果見圖1，空白溶液無干擾。

圖1 混合對照品（A）、復方珍珠解毒口服液樣品（B）和空白溶液（C）的HPLC色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed reference substance（A），CPDOL sample（B），and blank solution（C）

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 分別精密稱取對照品綠原酸5.13 mg、甘草苷1.74 mg、落新婦苷3.94 mg，置于100 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得綠原酸為51.3 μg·mL、甘草苷為16.2 μg·mL、落新婦苷為37.0 μg·mL的混合對照品溶液，4℃下保存，備用。

2.2.2 供試品溶液 精密量取復方珍珠解毒口服液5 mL，用50%甲醇定容至100 mL的量瓶中，搖勻，即得。

2.3 指紋圖譜的建立

2.3.1 精密度試驗 取“2.2.1”項下的混合對照品溶液，重復進樣6次，記錄綠原酸、甘草苷、落新婦苷的峰面積積分值，計算相對峰面積

RSD

值，結果依次為0.36%、0.38%、0.41%，表明儀器的精密度良好。2.3.2 穩定性試驗 取樣品（批號：190302）按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24 h后精密吸取10 μL，按“2.1”項下色譜條件測定。結果綠原酸、甘草苷、落新婦苷峰面積積分值的

RSD

依次為1.7%、1.9%、1.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。2.3.3 重復性試驗 取樣品（批號：190302），按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算綠原酸、甘草苷、落新婦苷峰面積積分值的

RSD

，結果分別為0.77%、1.1%、0.98%，表明方法的重復性良好。

2.3.4 指紋圖譜的建立、相似度評價及共有峰指認 取10批樣品（S1～S10），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并將其指紋圖譜導入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》，以S1為參照，使用平均數進行自動匹配，加以多點校正，生成指紋圖譜共有模式。10批樣品均具有基本一致的特征峰，共標定出10個共有峰。精密吸取混合對照品溶液進樣測定，通過與對照品的保留時間進行比對，指認了綠原酸（1號峰）、甘草苷（4號峰）、落新婦苷（5號峰）。色譜分析結果見圖2。

圖2 10批復方珍珠解毒口服液樣品的HPLC的指紋圖譜及其對照指紋圖譜（R）Fig 2 HPLC fingerprint of 10 batches of CPDOL samples and reference fingerprint（R）

以共有模式作為對照指紋圖譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統2012版》對復方珍珠解毒口服液樣品指紋圖譜進行相似度的評價。結果10個批次樣品的相似度均大于0.990，表明10批樣品具有良好的一致性，本方法可用于綜合評價復方珍珠解毒口服液的整體質量（見表1）。

表1 10批復方珍珠解毒口服液樣品指紋圖譜相似度
Tab 1 Fingerprints similarity of 10 batches of CPDOL samples

批號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 對照峰S1 1.000 S2 0.999 1.000 S3 0.997 0.998 1.000 S4 0.995 0.996 0.999 1.000 S5 0.996 0.997 0.999 1.000 1.000 S6 0.998 0.999 0.998 0.997 0.998 1.000 S7 0.993 0.995 0.992 0.991 0.992 0.994 1.000 S8 0.993 0.993 0.991 0.990 0.990 0.993 0.999 1.000 S9 0.987 0.988 0.991 0.991 0.991 0.988 0.995 0.995 1.000 S10 0.993 0.993 0.990 0.990 0.991 0.993 0.999 0.999 0.996 1.000對照峰 0.998 0.998 0.998 0.997 0.998 0.998 0.998 0.997 0.995 0.997 1.000

2.4 QAMS測定3種成分含量

2.4.1 線性關系考察 吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液5、4、3、2、1、0.5 mL，分別置于10 mL量瓶中，用50%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，過0.45 μm濾膜后，按照“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄峰面積。以質量濃度（

X

）為橫坐標，峰面積（

Y

）為縱坐標繪制標準曲線，對其進行線性回歸，得回歸方程。綠原酸：

Y

＝8.993

X

＋0.3042，

r

＝0.9997，線性范圍為2.547～25.471 μg·mL；甘 草 苷：

Y

＝29.70

X

＋0.0413，

r

＝0.9999，線性范圍為0.810～8.100 μg·mL；落新婦苷：

Y

＝24.08

X

＋0.0499，

r

＝0.9998，線性范圍為1.662～16.621 μg·mL。結果表明各成分在各自的質量濃度范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.4.2 加樣回收試驗 分別精密量取已知含量的供試品溶液（批號：190302）9份，每份取5 mL，分別加入相當于綠原酸、甘草苷、落新婦苷含量的150%、100%、50%倍的各對照品溶液，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果綠原酸低、中、高濃度的平均回收率分別為107%、105%、105%，RSD分別為0.49%、0.82%、0.36%；甘草苷低、中、高濃度的平均回收率分別為99%、93%、104%，RSD分別為1.7%、1.8%、1.2%；落新婦苷低、中、高濃度的平均回收率分別 為93%、106%、102%，RSD分 別 為0.85%、0.74%、0.43%；表明方法的回收率較好。

2.4.3 相對校正因子的計算吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液8、10、15、20、25 μL，按“2.1”項下方法測定，記錄峰面積，以綠原酸為參照物，計算甘草苷、落新婦苷的相對校正因子（RCF）。計算公式為

f

＝

A

C

/

A

C

，其中

A

為綠原酸對照品峰面積，

A

為待測成分對照品峰面積，

C

為綠原酸對照品質量濃度，

C

為待測成分對照品質量濃度。結果甘草苷、落新婦苷的相對校正因子分別為0.2798和0.3160，

RSD

分別為0.53%和0.34%。結果見表2。

表2 以綠原酸為參照對其余2個成分的相對校正因子
Tab 2 RCF for the two components with chlorogenic acid as reference

進樣體積/μL f綠原酸/甘草苷 f綠原酸/落新婦苷8 0.2798 0.3158 10 0.2805 0.3160 15 0.2817 0.3172 20 0.2779 0.3144 25 0.2789 0.3167均值 0.2798 0.3160 RSD/% 0.53 0.34

2.4.4 方法耐用性考查及待測成分峰的定位 按“2.2.2”項下方法處理樣品，進樣檢測，考查不同柱溫[室溫（26.9℃）、30℃、40℃]，不同規格的色譜柱及不同品牌的高效液相色譜儀（見表3）的變化來測定樣品。結果顯示，柱溫對樣品的檢測沒有明顯的影響，不同色譜柱以及不同色譜儀不影響樣品的分離，方法耐用性好。

QAMS能否有效應用的關鍵在于待測成分色譜峰的定位是否準確。本試驗采用相對保留值定位方法考察不同色譜柱及高效液相色譜儀各成分之間相對保留值的重現性。結果顯示在不同的儀器和色譜柱中，各指標成分相對保留時間的

RSD

均小于2%，色譜峰定位準確，重現性良好（見表3）。

表3 不同儀器和色譜柱相對保留時間的比較
Tab 3 Relative retention time of different instruments and chromatographic columns

儀器 色譜柱 相對保留時間綠原酸 甘草苷 落新婦苷安捷倫1260 Agilent 5TC-C18（2） 1 0.658 0.632 Xselect HSS C18 SB 1 0.659 0.634島津LC20A Agilent 5TC-C18（2） 1 0.659 0.633 Xselect HSS C18 SB 1 0.657 0.632均值 1 0.658 0.633 RSD/% 0 0.15 0.15

2.4.5 外標法與QAMS的含量測定結果 分別精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液，10批復方珍珠解毒口服液樣品（S1～S10）按照“2.2.2”項下方法制備，注入高效液相色譜儀，按照“2.1”項下色譜條件測定。采用外標法測定復方珍珠解毒口服液中綠原酸、甘草苷、落新婦苷3種成分的含量；以綠原酸為參照物，采用QAMS測定甘草苷和落新婦苷2種有效成分的含量。結果表明，使用外標法和QAMS測定復方珍珠解毒口服液中3種成分的含量基本一致，說明QAMS在復方珍珠解毒口服液多指標成分質量控制中的應用是可靠、穩定、準確的。結果見表4。

表4 QAMS法與外標法測定復方珍珠解毒口服液中3種成分的含量(mg·mL)
Tab 4 Determination of 3 components in 10 batches of CPDOL by QAMS and external standard method (mg·mL)

批次 綠原酸 甘草苷 落新婦苷QAMS外標法RSD/% QAMS外標法RSD/%S1 0.818 0.229 0.234 0.68 0.617 0.623 0.65 S2 0.831 0.233 0.236 0.77 0.616 0.628 1.35 S3 0.838 0.230 0.233 1.05 0.608 0.615 0.77 S4 0.823 0.234 0.236 0.52 0.613 0.622 0.98 S5 0.833 0.228 0.234 1.90 0.610 0.620 1.10 S6 0.834 0.234 0.237 0.98 0.625 0.635 1.13 S7 0.845 0.238 0.240 0.72 0.635 0.646 1.27 S8 0.822 0.240 0.240 0.47 0.615 0.606 1.03 S9 0.824 0.238 0.237 0.22 0.612 0.625 1.45 S10 0.837 0.240 0.236 1.20 0.619 0.623 0.51

3 討論

本研究在進行HPLC分析時，比較了水飽和正丁醇萃取法和甲醇提取法制備供試品。經比較發現，甲醇提取法所得圖譜出峰數量多、信息量較大，成分干擾少，故選擇甲醇超聲處理供試品溶液。

通過二極管陣列檢測器（DAD）在190～600 nm波長下對樣品進行全波長掃描，發現在220 nm波長下，圖譜基線平穩、色譜峰較多、峰形較好，所提供的信息最豐富，因此選擇220 nm作為指紋圖譜的檢測波長。

考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%醋酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.05%甲酸水溶液5種流動相系統。最后，綜合考慮峰形、分離度、出峰數等因素選擇乙腈-0.5%磷酸水溶液作為流動相。

復方珍珠解毒口服液組方包括6味藥材，成分復雜，采用220 nm作為檢測波長建立指紋圖譜，雖然信息量較其他波長更為豐富，但仍難以涵蓋全方所有藥味。本研究建立的QAMS，在原有質量標準控制綠原酸含量的基礎上，擬最大限度選擇合適的標志性成分，盡量涵蓋組方中大多數藥味。在組方的6味藥材中，珍珠層粉和龜甲的主要標志性成分利用HPLC方法難以檢識；地黃的主要成分梓醇等在本研究中未能檢測到。上述成分的檢測或需要更精確的檢測儀器比如HPLC-MS。因此，本研究選擇了綠原酸（金銀花的標志性成分）、甘草苷（甘草的標志性成分）和落新婦苷（土茯苓的標志性成分）作為研究對象，建立的QAMS涵蓋了組方中的3味藥材。在今后的研究中，應對珍珠層粉、龜甲、地黃等進行深入研究，優化檢測方法，必要時采用HPLC-MS方法，或進一步開發多波長指紋圖譜、不同極性部位指紋圖譜等方法，并深入研究其譜效關系。在此基礎上，將譜效關系和分子對接方法結合起來，研究并確認其與功能主治相關的有效成分，將對該藥品的質量控制研究起到更好的指導作用，以期全面控制該藥品的質量一致性，保證用藥安全。