蒙藥醋浸甘草對四氯化碳聯合高脂飲食誘導的大鼠肝纖維化的改善作用

薩出拉，包書茵，那生桑，奧烏力吉*（.內蒙古民族大學，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古中蒙醫藥研究院，呼和浩特 00020；3.內蒙古醫科大學，呼和浩特 00059）

肝纖維化主要表現為肝內細胞外基質增生或過度沉積，隨著病情的發展演變為肝硬化，在此進程中及時介入治療、去除刺激因素則可逆轉肝纖維化的發展，因此通過抗纖維化來阻斷肝硬化。據文獻報道甘草活性成分能夠有效防治肝纖維化，且國內對甘草酸代謝產物的研究成為熱點。口服甘草酸后，由膽汁排泄進入腸道，一部分被排泄，另一部分甘草酸經腸道菌群作用水解為甘草次酸；甘草次酸經腸肝循環再次進入肝臟發揮藥效。而患者腸道菌群混亂，甘草酸不能被正常水解，從而藥效降低。因此，通過蒙藥炮制甘草，將促進甘草次酸的水解，從而提高藥效，可為研發有效治療肝纖維化的藥物奠定基礎。

醋浸甘草為豆科植物甘草

Glycyrrhiza uralensis

Fisch.、脹果甘草

Glycyrrhiza inflata

Bat.或光果甘草

Glycyrrhiza glabra

L.的干燥根和根莖的炮制加工品；其具有抗炎、抗氧化、免疫調節、抗病毒及保肝作用等生物活性。在老蒙醫專著《蒙藥醫語》中記載“甘草主治肝硬化，頗有療效”，經了解關鍵技術在于獨特的蒙醫炮制；在《內蒙古蒙藥炮制規范》地方標準已起草醋浸甘草質量標準草案。因本實驗通過四氯化碳（CCl）聯合高脂飲食誘導肝纖維化，初步驗證蒙藥醋浸甘草對肝纖維化改善作用。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠（220～250 g）（上海斯萊克實驗動物有限公司；動物合格證號：2017000 5049408）。在正常光周期環境中（晝夜交替12 h），溫度（24±2）℃，濕度（50±5）%，對大鼠供應正常飼料和飲用水，置于籠內適應性飼養7 d。

1.2 試藥

甘草藥材（共3批次，批號：181113，甘肅岷縣，批號：181210，新疆伊犁，批號：181211，內蒙古包頭，均購自亳州康美中藥城），經內蒙古醫科大學藥學院教授渠弼鑒定為豆科科植物甘草（

Glycyrrhiza uralensis

Fisch.）的根，種植品，蒙藥名希和日-額布斯。

CMC-Na、CCl（貨號：30036328、10006464，國藥集團）；橄欖油、白酒、食用醋（超市采購）；高脂飼料（貨號：D12492，華雅思創生物有限公司）；秋水仙堿（貨號：C90102-1g，上海吉至生化科技有限公司）；谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST），血清透明質酸（HA）、層粘連蛋白（LN）和Ⅲ型前膠原肽（PⅢP）檢測試劑盒（ELK Biotechnology）；4%多聚甲醛、Masson三色染色液（武漢谷歌生物科技有限公司）；蘇木精染液、伊紅染液（珠海貝索生物技術有限公司）；封閉用羊血清、DAB顯色液（北京中杉金橋）；CYP2E1抗體、NRF2抗體（Affinity）；無水乙醇、二甲苯、中性樹膠、戊巴比妥鈉（國藥集團）；Goat Anti-Rabbit IgG HRP（H＋L）二抗（貨號：111-035-045，Jackson ImmunoResearch）。

1.3 儀器

分析天平（美國OHAUS）；離心機（Eppendorf）；酶標儀（Thermo）；石蠟包埋機、冷卻臺（浙江科迪儀器設備）；石蠟切片機（Thermo scientific）；展片機、烤片機（天津天利航空機電）；恒溫培養箱（上海精宏）；倒置顯微鏡（Olympus公司）；雪花制冰機（雪科）；漩渦混合器（齊林貝爾）；烘箱（上海精宏）。

2 方法

2.1 甘草炮制方法與給藥液的制備

2.1.1 甘草的炮制方法 取甘草藥材，除去雜質，水浸泡2 d，切厚片，干燥，食醋浸泡1 d冷透，趁濕加壓蒸煮20 h，干燥；用時碎成粉末；品名為醋浸甘草，在內蒙古蒙藥炮制規范（2020年版）載入。

2.1.2 醋浸甘草（給藥液）制備 取醋浸甘草粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液；按照2020年版《中國藥典》甘草項下的方法測定3批醋浸甘草含甘草次酸（CHO）含量為均不少于0.90%。將炮制品粉碎，臨用時用0.5% CMC-Na溶液研磨，制成一定黏度的混懸液，備用（灌胃）。

2.2 大鼠造模、分組及給藥

2.2.1 大鼠肝纖維化造模 隨機將大鼠分為2組，對照組（control）13只，模型組69只。模型組大鼠皮下注射40%～60% CCl橄欖油溶液，0.3 mL/100 g，首劑加倍，每周2次，連續注射5周，同時給予高脂飼料和10%乙醇，第5周時成功肝纖維化造模。對照組大鼠供應正常飼料和飲用水，第2、4、5周的時候，隨機選擇3只大鼠處死，病理染色判斷模型進展。在注射后第5周，眼眶取血，轉入無抗凝劑的管子，室溫靜置30 min，然后4℃ 靜置3～4 h，用移液器吸取上層淡黃色血清，轉入離心管中，4℃條件下離心（3000 g，15 min），小心取上清液轉入新的管子，ELISA檢測ALT、AST、HA、LN和PⅢP。

2.2.2 分組及給藥 隨機將造模成功大鼠分為6組，分別為模型組（model）、陽性組（Col）、醋液組（Vin）、給藥組（低、中、高）。陽性組給予秋水仙堿1.5 mg·kg，皮下注射；醋液組給予醋液2 mL·kg，灌胃給藥；給藥組（低劑量0.8 g·kg、中劑量2.5 g·kg、高劑量5 g·kg）灌胃給藥，持續4周。

2.3 樣本收集

給藥4周后，大鼠禁食水16 h，先給予大鼠麻醉，腹主動脈取血，轉入無抗凝劑的管子，室溫靜置30 min，然后4℃靜置3～4 h。吸取上層淡黃色血清，轉入新的離心管中，4℃條件下離心（3000 g，15 min），小心取上清液轉入新的管子。取肝臟，用4%多聚甲醛固定保存，觀察肝臟變化。

2.4 肝功能及肝纖維化指標測定

血清全自動生化分析儀測定肝功能指標ALT、AST、HA、LN和PⅢP水平。

2.5 肝組織病理學檢測

取各鼠相同部位肝葉，10%甲醛固定進行HE和Masson染色，光學顯微鏡下觀察肝組織纖維化程度。

2.6 肝組織中CYP2E1和Nrf2的測定

取材，選取待染色切片，烤片，62℃1 h；切片脫蠟，復水；抗原修復；封閉內源性過氧化物酶；孵育抗體；DAB顯色1 min，自來水終止顯色，鏡檢；蘇木素復染；脫水，透明；中性樹膠封片；進行200倍視野采集圖片。

2.7 統計分析

實驗結果采用SPSS 19.0軟件分析數據進行單因素方差分析，作圖軟件為Graphpad prism 5，

P

＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠肝纖維化造模結果

給藥前大鼠血清檢測結果表明，與對照組比較，模型組的大鼠血清ALT、AST、HA、LN和PⅢP均顯著升高（

P

＜0.05）（見圖1）。

圖1 給藥前大鼠血清ELISA檢測結果Fig 1 ELISA detection in rat serum before the administration

大鼠肝纖維化造模HE染色結果見圖2，大鼠肝纖維化模型組第2周空泡變性較多（大空泡為主），因脂肪變受壓致使結構變形（大致輪廓可見），大量炎癥細胞浸潤；第4周炎癥細胞浸潤，纖維沉淀清晰可見；第5周結構紊亂，邊界不清晰，肝細胞壞死嚴重，纖維沉淀較多。對照組結構清晰，形態正常，肝索間隙擴張。

圖2 給藥前大鼠肝纖維化造模后HE染色和Masson染色（×200）Fig 2 HE staining and Masson staining after hepatic fibrosis modeling in rats before the administration（×200）

大鼠肝纖維化造模Masson染色結果所示，大鼠肝組織模型組第2周中央靜脈和匯管區有較淡的藍色（纖維化沉淀），大空泡變性為主，較多炎癥細胞浸潤；第4周空泡變性嚴重，有炎癥細胞浸潤，有較多纖維化增生和沉淀，肝細胞壞死較多；第5周肝細胞之間的橋接和肝中央靜脈部分纖維化增生明顯，空泡變小，變多，肝細胞有大量死亡。空白對照組無特殊性變化，結構和形態基本正常，少量肝索間隙增大。

3.2 大鼠肝功能及肝纖維化指標的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP水平均顯著升高；與模型組比較，陽性組大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP的水平均顯著降低，給藥組SD大鼠血清ALT、AST、HA、LN及PⅢP的水平均顯著降低（見圖3）。

圖3 大鼠肝纖維化肝功能及肝纖維化指標影響Fig 3 Effect of hepatic fibrosis on liver function and indexes of hepatic fibrosis in rats

3.3 肝病理組織形態觀察

HE結果顯示（見圖4）：對照組肝索間隙增大；模型組有肝細胞增生和纖維化增生，結構紊亂，肝索間隙增大；醋液組和模型組的病理變化相似；陽性組結構基本正常，有少量肝細胞和纖維增生；低、中、高濃度組的樣本結構逐漸好轉，膠原纖維增生，隨著濃度的增加，逐漸減少。Masson結果顯示（見圖5）：對照組門靜脈區有少量藍色（顯示有少量的纖維存在），模型組匯管區和中央靜脈有粗大的纖維化著色（藍色），醋液組和模型組幾乎無差別（有較多的藍色存在）；秋水仙堿組肝索間隙增大，結構有點紊亂，有少量纖維存在（藍色區域）；低、中、高濃度甘草浸液存在一定的量效關系，隨劑量增大，組織間隙減小，橋接纖維著色變淡、變細。根據上述說明，醋浸甘草對大鼠纖維化模型具有治療效果。

圖4 大鼠肝纖維化造模后HE染色圖（×200）Fig 4 HE staining after the modeling of hepatic fibrosis in rats（×200）

圖5 大鼠肝纖維化造模后Masson染色圖（×200）Fig 5 Masson staining after the modeling of hepatic fibrosis in rats（×200）

3.4 肝組織CYP2E1和Nrf2水平的影響

如圖6～7所示，模型組大鼠CYP2E1和Nrf2陽性表達明顯為棕色；且位于細胞胞漿中。秋水仙堿組大鼠組織中少見棕色；不同劑量給藥后，肝組織中CYP2E1和Nrf2的表達不同程度地減少。定量分析結果如圖8所示，與對照組相比，模型組大鼠肝組織的CYP2E1和Nrf2水平顯著升高（

P

＜0.05）；與模型組相比，陽性組大鼠肝組織的CYP2E1和Nrf2水平顯著下降（

P

＜0.05），給藥組大鼠肝組織CYP2E1和Nrf2的水平有所下降（

P

＜0.05）；而醋液組幾乎沒變化。給藥組高劑量效果略等同于陽性組，說明醋浸甘草有明顯改善肝纖維化作用，且呈劑量依賴性。

圖6 大鼠肝纖維化造模后肝組織CYP2E1免疫組化染色圖（×200）Fig 6 Immunohistochemical staining of CYP2E1 in liver tissue of rats with hepatic fibrosis（×200）

圖7 大鼠肝纖維化造模后肝組織Nrf2免疫組化染色圖（×200）Fig 7 Immunohistochemical staining of Nrf2 in liver tissue of rats with hepatic fibrosis（×200）

圖8 大鼠肝纖維化造模后肝組織CYP2E1和Nrf2水平的影響Fig 8 Effect of hepatic CYP2E1 and Nrf2 in rats with hepatic fibrosis

4 討論

蒙醫藥是我國傳統醫藥學的重要組成部分，是蒙古族人經驗的積累，將有毒、銳性強等藥物，經炮制后可降低或消除藥物的毒副作用、改變或緩和藥性，提高藥物療效，蒙藥炮制在保證蒙藥療效、用藥安全等方面發揮重要作用。《蒙藥醫語》中記載“甘草具有抗肝硬化作用”，可應用蒙醫炮制方法炮制甘草，從而治療肝纖維化。肝纖維化是臨床多發的疾病，也是慢性肝病進展為肝硬化的必要環節，可常規中西藥治療肝纖維化臨床效果不顯著，本研究為研發具有獨特的蒙藥醋浸甘草有效治療肝纖維化的藥物奠定基礎。

甘草是蒙醫常用的藥材，具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、降血脂、改善胰島素抵抗以及調節免疫功能等諸多作用；尤其在國內外抗纖維化方面研究的較多；有文獻報道表明，利用多種方法改造或修飾化學結構獲得甘草次酸及其衍生物，從而提高甘草次酸的生物利用度。也有研究報道，甘草酸由于腸道菌群紊亂不能被正常水解，在臨床上出現假醛固酮增多癥，應用被限制。根據實驗結果初步推測蒙醫炮制醋浸甘草可減少假醛固酮增多癥，從而有效改善肝纖維化。本實驗采用化學毒性的CCl與高脂飲食聯合誘發肝纖維化動物模型，此造模方法應用廣泛，費用低，操作簡易，造模成功率較高。結果表明，與對照組相比較，模型組肝功能指標（ALT、AST）顯著增加，肝纖維化指標（HA、LA、PⅢP）明顯升高；通過觀察HE和Masson染色發現第5周時模型組大鼠肝細胞壞死嚴重，肝纖維化明顯增生；說明CCl與高脂飲食聯合成功誘導大鼠肝纖維化模型。與模型組對比，給藥組肝功能和肝纖維化（ALT、AST、HA、LA、PⅢP）等指標顯著降低；肝組織細胞色素CYP2E1與轉錄因子Nrf2水平顯著降低，說明給藥后大鼠肝纖維化明顯改善；與模型組對比，醋液組差異無統計學意義，說明醋液對肝纖維化無明顯影響。

綜上，本研究蒙藥醋浸甘草飲片與修飾甘草衍生物化學結構相比操作簡單、費用低，且蒙醫臨床實踐發現療效較好，具有鮮明的民族特色。并初步驗證醋浸甘草能有效改善CCl高脂聯合誘導的大鼠肝纖維化作用，為研發有效治療肝纖維化的蒙藥醋浸甘草提供理論依據。