UPLC-MS/MS法快速測定多效唑在麥冬中的殘留及其對麥冬化學成分的影響

俞磊明，張娜，李琦，朱光明，黃維，王衛華，姜云耀*（.上海市藥材有限公司，上海 0008；.清華大學藥學院 中藥研究院，北京 00084；.清華大學藥學院 藥物藥學技術中心代謝平臺，北京 00084）

中藥麥冬為百合科沿階草屬植物麥冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的 干 燥 塊根，在《神農本草經》中被列為上品。麥冬味甘、微苦、性涼，有養陰生津、清心除煩的功效，且有抗血栓、抗衰老、降血糖、免疫調節、心肌保護等藥理活性。近年來，麥冬市場需求不斷擴大，為確保產量，麥冬栽培品中農藥、植物生長調節劑的使用越來越頻繁。據報道，四川栽培的麥冬（川麥冬）植物生長調節劑用量較大，過度使用植物生長調節劑影響麥冬的品質和安全性。多效唑是麥冬種植中廣泛應用的三唑類植物生長延緩劑，對麥冬塊根增產效果顯著，目前已成為麥冬藥材種植中普遍施用的生長激素。本研究建立了UPLCMS/MS法測定麥冬中多效唑殘留情況，同時采用UPLC-QTOF-MS及紫外分光光度法對麥冬進行整體成分分析、總黃酮及總皂苷含量測定，探討多效唑對麥冬化學成分的影響，以期為麥冬藥材的質量控制及多效唑殘留檢測提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC，美國沃特世公司）；三重四極桿質譜儀（Qtrap 4500，美國AB SCIEX公司）；分析天平（BSA224S，賽多利斯科學儀器有限公司）；超聲波清洗器（SB25-12DTD，寧波新芝生物科技股份有限公司）；中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；離心機（美國賽默飛世爾科技公司）；超高效液相-串聯四極桿飛行時間高分辨質譜儀（Waters Synapt G2 Si，美國沃特世公司）；UV-2600紫外分光光度計（島津儀器蘇州有限公司）。

1.2 試藥

所有麥冬藥材由上海市藥材有限公司提供，經清華大學中藥研究院特聘研究員陳軍力鑒定為百合科沿階草屬植物麥冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的干燥塊根；多效唑對照品（純度≥95%，批號：Q21M9F61825，上海源葉生物科技有限公司）；魯斯可皂苷元（純度≥98%，批號：111909-201906，中國食品藥品檢定研究院）；橙皮苷（純度≥98%，批號：K09S11L123847，上海源葉生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸、異丙醇（均為質譜純，美國Thermo Fisher公司）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 UPLC-MS/MS快速測定麥冬中多效唑的殘留

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取多效唑對照品適量，置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 μg·mL的多效唑對照品儲備液，4℃冷藏待用。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取麥冬藥材粉末0.2 g，加1.5 mL異丙醇，超聲提取30 min（功 率50 kHz，100 W），13 000 r·min離 心10 min，取上清液1 mL，濃縮至干，加入100 μL 50%的甲醇復溶，13 000 r·min離心10 min，取上清液，作為供試品溶液備用。

2.1.3 色譜和質譜條件 色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH C色 譜 柱（50 mm×2.1 mm，1.7μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～3 min：20%～100%A；3～5 min：100%A；5.1～ 8 min：20%A），流 速0.2 mL·min，柱溫30℃，進樣量10 μL。電噴霧正離子電離模式，多反應監測法測定，參數如下：氣簾氣（CUR）30 psi，離子源溫度（TEM）500℃；錐孔電壓（IS）5500 V；輔助氣（GS1、GS2）50 psi。質譜采集參數見表1，色譜圖見圖1。

圖1 多效唑對照品（A）和麥冬樣品（B）的UPLC-MS/MS色譜圖Fig 1 UPLC-MS/MS chromatograms of paclobutrazol（A）and Ophiopogonis Radix（B）

表1 目標化合物質譜檢測離子和采集參數
Tab 1 Spectrum acquisition parameters for target compound

參數 值Q1 294.3 Q3 70.1 DP/V 120 CE/V 46 CXP/V 11

2.1.4 線性關系考察 精密吸取多效唑對照品儲備液，用50%甲醇稀釋成質量濃度為500、200、50、10、2、0.5、0.2 ng·mL的多效唑對照品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定。以多效唑對照品進樣量（ng）為橫坐標，定量離子對峰面積為縱坐標進行線性回歸，得到多效唑的回歸方程為

Y

＝87.02

X

＋5.354（

r

＝0.9973）。結果表明，多效唑在0.002～5 ng與峰面積呈良好的線性關系。2.1.5 精密度試驗 精密吸取多效唑對照品溶液10 μL，按“2.1.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄對照品峰面積。結果多效唑峰面積的

RSD

值為0.80%，表明儀器精密度良好。2.1.6 穩定性試驗 取11號麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液。分別于0、2、4、8、12、24 h按“2.1.3”項下色譜條件測定。結果顯示，多效唑峰面積的

RSD

值為1.4%，表明供試品溶液在24 h內穩定。2.1.7 重復性試驗 取11號麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備6份供試品溶液。按“2.1.3”項下色譜條件測定，計算質量分數。結果顯示，多效唑峰面積的

RSD

值為1.1%，表明該方法重復性良好。2.1.8 加樣回收試驗 取11號麥冬藥材樣品6份，每份約0.1 g，精密稱定，分別加入相當于供試品中多效唑含量100%的對照品。按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，進樣測定，并計算回收率和

RSD

值。結果多效唑平均回收率為98.0%，

RSD

值為1.8%，表明該方法的加樣回收率良好。

2.1.9 樣品含量測定 取16批麥冬藥材樣品，按“2.1.2”項下方法制備成供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件測定，計算各樣品中多效唑的含量。結果見表2，在四川栽培的麥冬藥材樣品中全部檢測到多效唑的殘留，而在湖南和上海的野生麥冬樣品中均未檢測到多效唑的殘留。

表2 麥冬樣品中多效唑殘留情況
Tab 2 Content of paclobutrazol in Ophiopogonis Radix

樣品編號 產地 多效唑含量/（mg·kg－1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16四川綿陽三臺縣四川綿陽三臺縣四川綿陽三臺縣四川綿陽三臺縣四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川綿陽四川（萬仕城1號）四川（萬仕城2號）四川（代代為本特級）四川（代代為本一級）四川（代代為本一級）湖南（野生）上海（野生）0.006 0.012 0.013 0.015 0.015 0.015 0.049 0.016 0.019 0.007 0.027 0.005 0.002 0.014未檢出未檢出

2.2 多效唑對麥冬整體化學成分的影響研究

2.2.1 供試品溶液的制備 采用UPLC-QTOFMS植物代謝組學法初步研究多效唑施用與否對麥冬整體化學成分的影響，麥冬樣品信息見表3。取麥冬藥材樣品粉末0.2 g于15 mL離心管中，加入5 mL70%甲醇溶液，超聲提取30 min，混勻，取1 mL超聲提取液12 000 r·min離心15 min后，取上清液備用。另等量吸取各供試品溶液100 μL，混勻，制成質量控制（quality control，QC）樣品，用于監測分析系統和方法的穩定性。

表3 施用不同濃度多效唑的麥冬樣品信息
Tab 3 Information of Ophiopogonis Radix samples treated with different concentrations of paclobutrazol

樣品編號 多效唑施用量/（g·m－2）D0 D1 D2 D3 0 1.0 4.0 8.0

2.2.2 檢測條件 色譜條件：Waters ACQUITY BEH C色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動相為0.1%的甲酸水溶液（A）-0.1%的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%～40%B；5～17 min，40%～98%B；17～20 min，98%B；20.1～21 min，2%B），流速為0.3 mL·min，柱溫40℃，進樣量2.0μL。質譜條件：離子源為電噴霧（electrospray ionization，ESI）源；采用MS負離子掃描模式，毛細管電壓2.0 kV，離子源溫度120℃，脫溶劑氣溫度450℃，脫溶劑氣流速800 L·h，錐孔電壓40 V，錐孔氣流速50 L·h，采集模式質量范圍

m

/

z

50～1500，掃描時間0.2 s，高能通道碰撞電壓10～75 V，亮氨酸-腦啡肽

m

/

z

556.2615[M-H]作質量實時校正。

2.2.3 數據采集與分析

① 數據采集：分析樣品前測試空白溶劑樣品，扣除色譜柱和系統中的殘留污染干擾。連續進樣10次QC樣品，待儀器檢測穩定后，進行實際樣品檢測。實際樣品隨機排列，并按采樣數量等間隔插入QC樣品。

② 數據分析：將LC-MS的原始數據導入Progenesis QI 軟件（Version 2.0，Waters）進行預處理，得到包含保留時間、質荷比和峰強度的二維數據矩陣，保存為.csv格式，MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca）網站有監督的偏最小二乘判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA），通過多元統計分析判斷多效唑施用對麥冬整體化學成分的影響。多元統計分析結果見圖2，結果中清水對照組麥冬與多效唑不同濃度的麥冬分布在不同區域，可見，施用多效唑對麥冬整體化學成分存在顯著的影響。

圖2 多效唑對麥冬整體化學成分影響的多元統計分析（PLS-DA）Fig 2 Multivariate statistical analysis of the effect of paclobutrazol on the whole chemical constituents of Ophiopogonis Radix（PLS-DA）

2.3 多效唑對麥冬總皂苷和總黃酮的影響

采用紫外分光光度法對“2.2.1”項下的麥冬藥材進行總皂苷和總黃酮的含量測定，分析多效唑施用對麥冬總皂苷和總黃酮的影響。總皂苷樣品制備及檢測方法參照2020年版《中國藥典》，總黃酮樣品制備及檢測方法參考文獻報道，采用橙皮苷為對照品進行測定。結果見表5，施用多效唑后麥冬總黃酮含量明顯降低，而麥冬總皂苷含量無變化。

表5 多效唑施用量對麥冬總皂苷、總黃酮的影響(＝3)
Tab 5 Effect of paclobutrazol on total saponins and flavonoids of Ophiopogonis Radix(＝3)

樣品編號 總皂苷含量/% 總黃酮含量/%D0 D1 D2 D3 0.40 0.40 0.40 0.40 0.021 0.014 0.014 0.014

3 討論

3.1 測定方法的考察

本研究前期采用液相方法檢測麥冬藥材中多效唑殘留情況，發現色譜峰無法準確定量，故選擇采用質譜儀建立麥冬多效唑殘留的檢測方法。考察了甲醇、80%甲醇、異丙醇3種不同提取溶劑對麥冬中多效唑殘留提取效率的影響，結果發現異丙醇提取效率最高，故提取溶劑選擇異丙醇。多效唑殘留在果蔬和土壤中的檢測報道較多，近幾年，中藥材尤其是川麥冬中多效唑殘留檢測方法研究增多，大都采用液相色譜-質譜聯用方法。由于樣品中多效唑殘留量較低，文獻報道的麥冬多效唑檢測方法多采用液液萃取法和QuEChERS法提取，方法復雜，且耗時長。本研究采用異丙醇為溶劑，直接超聲提取，濃縮富集后測定，方法更加簡便、快捷。

3.2 麥冬藥材中多效唑殘留分析

多效唑是一種三唑類植物生長調節劑，20世紀80年代研制出后被廣泛用于塊根類植物增產，其機制是通過抑制植物內源性激素赤霉素的合成提高植物組織中吲哚乙酸氧化酶活性，從而減弱植物頂端分裂活性，促進植物塊根形成。多效唑具有低毒性，人體每日允許攝入量為0.1 mg·kg，我國規定部分果蔬中多效唑檢出限量為0.05 mg·kg。中藥材中尚無相關限量標準，據報道，多效唑施用后在土壤中殘留情況較為嚴重，殘留年限可達2年，對土壤微生物及后茬作物均有影響。因此，加快建立中藥材多效唑殘留限量標準，對中藥材安全性控制和土壤環境安全保護均有一定的價值。本研究檢測結果中四川麥冬栽培品普遍可檢出多效唑殘留，殘留量在0.002～0.05 mg·kg，而湖南和上海的野生麥冬則無多效唑殘留檢出。這說明，川麥冬藥材栽培品施用多效唑情況較為普遍，藥材種植過程中多效唑施用量各不相同。據文獻報道，川麥冬種植過程存在多效唑濫用情況，有學者采用質譜法測定了60批川麥冬中108種植物生長激素殘留，其中多效唑檢出率高達100%，檢出質量濃度在0.004 18～0.0639 mg·kg，在108種激素中施用情況最為嚴重。也有學者采用QuEChERS提取與反相色譜-質譜聯用方法測定麥冬藥材中多效唑和烯效唑的殘留，在33批藥材樣品中多效唑的檢出率為94%，而烯效唑的檢出率僅為27%，多效唑殘留量在0.02～0.208 mg·kg。本研究結果與文獻報道具有高度一致性。因此，本研究建立的快速測定麥冬多效唑殘留的方法可為中藥材生長調節劑限量評估提供研究基礎，為國家監管部門形成針對中藥材生長激素殘留限量的標準提供一定參考。

3.3 施用多效唑對麥冬成分的影響

本試驗通過UPLC-QTOF-MS植物代謝組學技術和多元統計分析方法研究多效唑施用對麥冬整體化學成分的影響，發現多效唑施用后對麥冬的化學成分存在影響，通過測定麥冬總皂苷、總黃酮的含量，初步判斷施用多效唑后麥冬總黃酮含量下降。