猴耳環消炎片指紋譜效學分析

趙斯塵，王曉東，吳灝，彭維，陳曌，蘇薇薇，王永剛*（.中山大學生命科學學院/廣東省中藥上市后質量與藥效再評價工程技術研究中心，廣州 5075；.廣州白云山花城藥業有限公司，廣州 50555）

南藥猴耳環[

Archidendron clypearia

（Jack）I.C.Nielsen]是豆科含羞草亞科猴耳環屬植物猴耳環的干燥葉，具有消炎鎮痛，抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant

staphylococcus aureus

，MRSA）、黃嘌呤氧化酶、流感病毒、

β

-淀粉樣聚集活性，治療上呼吸道感染、細菌性腸炎等多種藥理作用。猴耳環消炎片是由猴耳環提取制成的中藥制劑，已在臨床使用多年，現階段在《中國藥典》中僅對猴耳環消炎片的沒食子酸（不低于5.0%）、槲皮苷（不低于0.20%）含量進行控制，無法全面反映猴耳環消炎片的質量情況，及安全性、有效性。

中藥指紋圖譜是一種基于中藥化學成分系統研究、全面反映藥物化學信息的技術，建立猴耳環消炎片的指紋圖譜可較全面地反映猴耳環消炎片的化學信息。細菌耐藥是全球醫學界共同關注的問題，其中MRSA是一種臨床上常見的多重耐藥菌，威脅人類健康。本團隊前期研究表明猴耳環可降低MRSA的耐藥性。因此，本文首先基于高效液相色譜法（HPLC）構建了猴耳環消炎片指紋圖譜，確證了14個共有峰的化學成分，然后以體外抑菌活性為指標衡量藥物有效成分的抗菌效力。最后采用指紋譜效學分析技術，將其指紋圖譜與體外抑制MRSA的藥效相關聯，確定了猴耳環消炎片的藥效物質基礎，為猴耳環消炎片的質量控制提供了理論與實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

Thermo SCIENTIFIC液相色譜儀（包括二元泵、自動進樣器、柱溫控制模塊、UV檢測器均為DIONEX Ultimate 3000）；SHIMADZU超 快速高效液相色譜儀（包括二元泵LC-20AD-XR，自動進樣器SIL-20AD-XR，柱溫控制模塊CTO-20A）；AB SCIEX高分辨串聯質譜（Triple TOF 5600＋）；超純水機（Millipore Simplicity，美國密里博公司）；精密移液器（德國Eppendorf公司）；Sartorius電子天平（十萬分之一，BP211D）；滅 菌 鍋（GR 60DA）；DensiCHEK Plus比 濁 儀（VITEK2）；恒溫培養箱（常州諾基儀器有限公 司）；C色 譜 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm；Agilent ZORBAX Eclipse Plus C、Waters Symmetry C、太瑋科技 JADE-PAK ODS-AQ）。

1.2 試藥

磷 酸（批 號：P1508038，HPLC級85%～90%，阿拉丁）；甲酸（批號：0001408600，UHPLC/MS，Sigma）；乙腈、甲醇（HPLC級，Fisher Scientific）；肉湯培養基（OXOID）；無菌96孔板（康寧）；哥倫比亞血平板（廣東環凱微生物科技有限公司）。

沒食子酸（批號：C13O9C72105，純度≥98%）、楊梅苷（批號：D01031EA14，純度≥98%）（上海源葉生物科技有限公司）；表沒食子兒茶素（批號：MUST-21042810，純度：98.71%）、沒食子兒茶素（批號：MUST-21041804，純度：98.57%）、兒茶素（批號：DST210225，純度：98%）（成都德思特生物科技有限公司）；槲皮素（批號：3467，純度：99.3%）、槲皮苷（批號：5634，純度：98.0%）（NATURE STANDARD CO.，LTD.）；金絲桃苷（批號：11521-201809，純度：94.9%，中國食品藥品檢定研究院）；表兒茶素沒食子酸酯（批號：A1921031，純度≥98%，阿拉丁）。

猴耳環消炎片（17批，S1～S17）由廣州白云山花城藥業有限公司提供；MRSA（3株，SM1～M3）由中山大學附屬第一院臨床檢驗科微生物檢驗室鑒定并提供。

2 方法與結果

2.1 猴耳環消炎片指紋圖譜的構建

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取適量對照品，加75%甲醇制成每毫升含沒食子酸450 μg、金絲桃苷4 μg、表沒食子兒茶素15 μg、槲皮素5 μg、沒食子兒茶素15 μg、楊梅苷5 μg、兒茶素10 μg、表兒茶素沒食子酸酯10 μg、槲皮苷40 μg的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取消炎片10片，除去薄膜衣，研細，精密稱取0.240 g，置25 mL量瓶中，用75%甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，收集續濾液即得。

2.1.3 色譜條件 C色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；柱溫25℃，流速1.0 mL·min；流動相為乙腈（A）和pH為2.00的磷酸溶液（B），梯度洗脫：0→10 min，5%～10%A，10→65 min，10%～25%A。檢測波長：0→5.5 min為240 nm，5.5→65 min為208 nm。

2.1.4 方法學考察

① 專屬性試驗：取適量猴耳環消炎片、片劑輔料（淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂等按比例復配）按“2.1.2”項下方法制樣分析。如圖1所示，溶劑75%甲醇和輔料對分析無干擾，專屬性較好。

圖1 猴耳環消炎片（S1）和輔料（S2）的指紋圖譜Fig 1 Fingerprints of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets（S1）and excipients（S2）

② 精密度試驗：取同一供試品溶液連續進樣分析6次。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012.1版》進行相似度評價，以槲皮苷（12號峰）為參照峰（S峰），計算其他色譜峰的相對峰面積及其相對保留時間。結果6次指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.030%～0.35%和0.84%～2.5%，表明儀器精密度滿足要求。③ 方法重復性：取猴耳環消炎片平行制備6份供試品溶液并分析，結果6次指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.060%～0.45%和1.4%～3.6%，表明方法的重復性滿足要求。④ 穩定性試驗：取同一供試品溶液，于制備后 的0、8、16、24、32、40、48、56、64、72 h測定，結果10次指紋圖譜的相似度不低于0.999，14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.21%～0.57%和1.8%～4.6%，表明供試品溶液在72 h內穩定性良好。⑤ 耐用性試驗：取同一供試品溶液，以來自不同廠家的3種C色譜柱分析，不同色譜柱間指紋圖譜的相似度均為1.000，且14個共有峰的相對保留時間和相對峰面積的

RSD

值分別在0.060%～0.60%和0.90%～5.71%。表明Waters Symmetry C、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C、太瑋科技 JADE-PAK ODS-AQ 3種色譜柱均滿足分析要求。

2.1.5 猴耳環消炎片指紋圖譜共有峰的確證 收集猴耳環消炎片17批制備供試品溶液并分析。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012.1版》進行相似度評價，以編號S1的指紋圖譜為參照譜，進行峰匹配得到14個共有峰，17批指紋圖譜（見圖2）的相似度在0.927～0.995。通過對照品比較（見圖3），確證了1號峰為沒食子酸（CHO），2號峰為沒食子兒茶素（CHO），4號峰為表沒食子兒茶素（CHO），5號峰為兒茶素（CHO），9號峰為楊梅苷（CHO），10號峰為金絲桃苷（CHO），11號峰為表兒茶素沒食子酸酯（CHO），12號峰為槲皮苷（CHO），14號峰為槲皮素（CHO）；利用 LC-TOF /MS /MS技術手段，指證了 3號峰為木犀草苷（CHO）異構體，6號峰為5，7，3'，4'，5'-五羥基黃烷（CHO），7、8號峰為EGCG（CHO）異構體，13號峰為7-沒食子酰特利色黃烷（CHO）。

圖2 猴耳環消炎片（S1～S17）及其對照模式（R）的指紋圖譜疊加圖Fig 2 Stacking fingerprint of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets（S1～S17）and its comparison diagram（R）

圖3 猴耳環消炎片和混合對照品的指紋圖譜疊加圖Fig 3 Stacking fingerprint of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets and mixed reference

2.2 譜效學分析

2.2.1 猴耳環消炎片體外抑MRSA活性 菌株復蘇與傳代后，選取對數生長期的MRSA加入生理鹽水，調整菌液濃度為0.5麥氏單位，用M-H肉湯培養基稀釋100倍，精密移取50 μL于96孔板各孔中。將17批猴耳環消炎片和空白對照（輔料）分別用M-H肉湯培養基進行倍比稀釋，加50 μL 至上述含菌液的96孔板中，最終MRSA接種量約為1.0×10CFU·mL。將 96 孔板于37℃恒溫培養20 h，取澄清孔及其2倍、4倍、8倍濃度孔中溶液，于血瓊脂平板上劃線涂布。將血瓊脂平板于37℃培養24 h后，血瓊脂平板無菌落生長的濃度，即為最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，

MBC

），

MBC

結果如圖4所示（處理重復3次）。

圖4 17批猴耳環消炎片體外抑制MRSA活性的影響Fig 4 Inhibition of 17 batches of Archidendron clypearia antiphlogistic tablets on MRSA in vitro

2.2.2 關聯分析

① 灰色關聯分析：灰色關聯分析法分析各成分對于體外抗MRSA活性的影響程度，以

MBC

平均值的倒數為因變量，14個共有峰峰面積進行初值化處理后作為自變量，進行分析。針對14個評價項，關聯結果如表1所示，關聯度大于0.8的成分有12個，表明這12個成分與體外抑MRSA關聯度較高。

表1 猴耳環消炎片指紋圖譜共有峰與體外抗MRSA活性的關聯度
Tab 1 Correlation between common peaks in the fingerprints of antiphlogistic tablets and in vitro inhibition of MRSA

峰號 成分 關聯度值1 沒食子酸 0.968 12 槲皮苷 0.951 10 金絲桃苷 0.951 11 表兒茶素沒食子酸酯 0.932 5 兒茶素 0.926 14 槲皮素 0.900 9 楊梅苷 0.894 7 EGCG（C22H18O11）異構體1 0.885 2 沒食子兒茶素 0.852 4 表沒食子兒茶素 0.842 13 7-沒食子酰特利色黃烷 0.830 3 木犀草苷異構體（C21H20O11） 0.826 6 5，7，3'，4'，5'-五羥基黃烷（C15H14O6） 0.758 8 EGCG（C22H18O11）異構體2 0.644

② 偏最小二乘回歸（partial least squares，PLS）：由于多元線性回歸中，14個共有峰多重共線性嚴重（方差膨脹因子大于10），因此使用PLS回歸，建立猴耳環消炎片的譜-效關系模型。PLS回歸以

MBC

平均值的倒數為因變量

Y

，將共有峰峰面積初值化處理后作為自變量

X

，研究多個自變量

X

對于因變量

Y

的影響關系。PLS回歸擬合方程為

Y

＝0.815＋2.223

X

－2.143

X

－0.422

X

＋2.285

X

＋0.612

X

－0.116

X

－2.937

X

＋0.233

X

－0.519

X

－0.616

X

＋0.208

X

＋0.912

X

＋2.369

X

－1.403

X

。用R方值、預測誤差均方根（the root of mean square error prediction，RMSEP）對擬合效果進行評價，R方值為0.95，RMSEP值為0.038（見圖5），表明該模型擬合效果較好。PLS回歸方程以各自變量的系數值為權重系數反映各個自變量所對應的化學成分的相對重要性（見圖6）。猴耳環PLS回歸方程中系數大于0.6的活性成分為沒食子酸（共有峰1）、7-沒食子酰特利色黃烷（共有峰13）、表沒食子兒茶素（共有峰4）、槲皮苷（共有峰12）和兒茶素（共有峰5）。

圖5 RMSEP評估的擬合圖Fig 5 Fitting diagram of RMSEP evaluation

圖6 PLS回歸方程系數值的柱狀圖Fig 6 Histogram of coefficients in PLS regression equation

③ 綜合分析：綜合灰色關聯分析及PLS回歸分析結果，繪制Venn圖（見圖7），表明沒食子酸、表沒食子兒茶素、槲皮苷、7-沒食子酰特利色黃烷、兒茶素是猴耳環消炎片抗MRSA的主要藥效物質基礎。

圖7 灰色關聯分析結果和PLS回歸分析結果的Venn圖Fig 7 Venn diagram of analysis results of grey correlation and PLS regression

3 討論

中藥指紋圖譜技術涉及多種方法，其中HPLC分辨率高、靈敏度高、色譜柱可反復利用等優點，是中藥指紋圖譜的首選方法。本實驗建立的HPLC指紋圖譜，方法準確靈敏，穩定性和重復性好，指認和確證了14個共有成分，占總峰面積的90%以上，可用于猴耳環消炎片的質量控制。在此基礎上，以體外抑菌活性衡量藥物有效成分的抗菌效力，該方法操作簡便、條件易于控制，已廣泛應用于新藥研究和指導臨床用藥。

中藥譜效學以系統的化學成分研究和藥理學研究為依托，在指紋圖譜的基礎上對應藥效結果進行綜合分析。本文首先通過灰色關聯分析從共有成分中篩選灰色關聯度大于0.8的化學成分；然后通過PLS回歸分析篩選PLS回歸擬合方程中系數大于0.6的化學成分，最后綜合灰色關聯分析和PLS回歸分析，表明沒食子酸、7-沒食子酰特利色黃烷、兒茶素、槲皮苷、表沒食子兒茶素是主要藥效成分，這與文獻報道吻合。沒食子酸與兒茶素具有與不同化合物聯合增效的潛在應用。Mehrzadi等研究表明沒食子酸（200 mg·kg）與槲皮素（75 mg·kg）聯合給藥治療博來霉素誘導的肺纖維化大鼠的療效顯著優于單獨給藥。Qin等研究表明將兒茶素（128 μg·mL）和表兒茶素沒食子酸酯（16 μg·mL）聯合可顯著增強體外苯唑西林抗MRSA的作用。7-沒食子酰特利色黃烷為猴耳環的特有成分，是猴耳環發揮免疫調節和抗炎作用的潛在成分。槲皮苷可通過抑制金黃色葡萄球菌Sortase A靶點影響細菌黏附。

據此，闡明了猴耳環消炎片體外抑MRSA的主要藥效物質基礎。本研究為猴耳環消炎片的質量控制提供了理論與實驗依據。