養心生脈顆粒對異丙腎上腺素誘導的小鼠心肌缺血及焦慮樣行為的影響

張明倩，崔爽，梁五林，郭凡帆，歐文靜，伍永鴻，張仲毅，賈占紅，張碩峰*（.北京中

醫藥大學中藥學院，北京 102488；2.秦皇島市山海關藥業有限責任公司，河北 秦皇島 066000）

心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）具有高發病率、高致殘率和高病死率的特點，是世界范圍內引起死亡的主要原因[1]，心肌缺血（myocardial ischemia，MI）作為冠狀動脈疾病譜系的一部分，是指由于冠狀動脈供血和心肌耗氧量之間供需失衡，導致心臟供氧減少，心肌能量代謝不正常的一種病理綜合征[2-3]。臨床發現，心肌缺血患者常伴發焦慮抑郁等情緒障礙，其發病率遠高于正常人群，患者長期憂思恐懼、睡眠不足、緊張焦慮會增加疾病的發病率，影響疾病康復進程及患者生活質量[4]。

異丙腎上腺素（isoproterenol hydrochloride，ISO）是一種合成兒茶酚胺，高劑量服用可能會由于心肌耗氧量增大，冠狀動脈強烈收縮，外周阻力加大，心率加快，導致心肌缺血缺氧及心室功能障礙[5-6]。此外，一些臨床觀察證明，心率與焦慮或恐慌癥存在聯系，而恐慌癥患者的β-腎上腺素受體功能發生了改變。Leo等[7]研究證明，β-腎上腺素能受體激動劑ISO可升高心率，并且可能通過調節精神狀態的外周信號即細胞外囊泡誘發類似焦慮樣行為，而慢性焦慮又是心律失常和猝死的獨立危險因素[8]，故本實驗采用外源性兒茶酚胺類藥物ISO構建小鼠心肌缺血合并焦慮模型，避免了傳統手術造模復合慢性焦慮模型操作難度大、操作強度無標準等特點，較好的模擬了臨床缺血性心臟病伴焦慮樣狀態的表現。

養心生脈顆粒以生脈散為基礎方，由人參、麥冬、丹參、五味子、龍眼肉等14味中藥組成，具有益氣養陰、活血祛瘀之效，臨床應用該藥治療冠心病心絞痛取得了良好的效果，該藥多味單藥具有鎮靜安神的作用，在抗焦慮抑郁方面已有較深入的研究，為養心生脈顆粒臨床治療伴焦慮抑郁的冠心病患者提供了依據，故本研究觀察中藥養心生脈顆粒對ISO誘導的小鼠心肌缺血的保護作用及焦慮樣行為的藥效學作用，現報道如下。

1 材料

1.1 動物

SPF級KM小鼠72只，體質量19～22 g [北京斯貝福實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SYXK（京）2019-0010]，飼養溫度為（22±2）℃，自由獲取食物和飲用水，適應性飼養3 d。

1.2 試藥

養心生脈顆粒（秦皇島市山海關藥業有限責任公司，批號：20210206，規格：14 g/袋）；鹽酸異丙腎上腺素（上海源葉生物科技有限公司，批號：K2308B46335，HPLC≥98%）；復方丹參片（上海凱合榮圖們藥業有限公司，批號：202010125，規格：0.32 g/片）；地西泮（北京益民藥業有限公司，批號：20180403，規格：2.5 mg/片）。乳酸脫氫酶測定試劑盒（批號：20210901）、肌酸激酶測定試劑盒（批號：20210901）（凱基生物技術有限公司）。

1.3 儀器

信息化集成化信號采集與處理系統（成都泰盟軟件有限公司，型號：BL-420I），酶標儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號：MuttiSkan Mk3），低溫高速離心機（德國Eppendorf AG公司，型號：Centrifuge 5810），Noldus EthoVision XT9采集分析系統（荷蘭Noldus公司），Milli-Q超純水系統（默克密理博實驗室設備有限公司，型號：Milli-QAdvantage）。

2 方法

2.1 模型建立與給藥

72只小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性藥組，養心生脈顆粒低、中、高（3.15、6.30、12.60 g·kg－1）劑量組，每組12只。陽性藥組小鼠給予復方丹參片（0.432 g·kg－1）和地西泮（0.001 g·kg－1），劑量為0.02 mL·g－1，養心生脈顆粒組劑量均為0.04 mL·g－1，各給藥組小鼠連續灌胃給藥8 d。空白組、模型組小鼠給予等量的去離子水。第5日給藥30 min后，除空白組外其余各組小鼠腹腔注射60 mg·kg－1ISO，第6～8日腹腔注射50 mg·kg－1ISO，構建急性心肌缺血模型（空白組小鼠腹腔注射等量生理鹽水），于第7日造模8 h后進行行為學檢測，第8日造模后立即監測20 min內小鼠心電圖ST段變化，然后取血，檢測血清心肌酶的變化。

2.2 行為學檢測

2.2.1 高架十字迷宮實驗 實驗開始時，將小鼠面對開放臂放至迷宮的中心區，用Noldus EthoVision攝像并實時跟蹤記錄小鼠5 min內分別進入開放臂次數（OE）、封閉臂次數（CE）、開放臂滯留時間（OT）和封閉臂滯留時間（CT），由上述指標計算出：OT占比（%）＝OT/（OT＋CT）×100%；OE占比（%）＝OE/（OE＋CE）×100%。

2.2.2 明暗箱實驗 實驗開始時，將小鼠放入明箱中，使其背朝通道，攝像系統記錄下小鼠5 min內的活動情況，并記錄小鼠進入明箱的次數和進入明箱的時間。

2.2.3 曠場實驗 將小鼠置于Nodlus自主活動儀中央，規格為45 cm×45 cm×100 cm，應用Nodlus EthoVision動物軌跡與動物行為智能分析系統觀察并記錄5 min內小鼠進入中心區域的時間和次數及運動軌跡的總距離。測試完成后用酒精棉擦拭箱底，以免前一只小鼠遺留氣味對下一只實驗小鼠產生影響。

2.3 心電圖ST段變化

各組小鼠末次灌胃給藥1 h后，10%水合氯醛麻醉小鼠，運用BL-420I生物功能實驗系統，采用標準肢導聯，黑色皮下針頭插于右下肢皮下，白色皮下針頭插于右上肢皮下，紅色皮下針頭插于左下肢皮下，空白組小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射ISO，觀測小鼠Ⅱ導聯心電圖20 min，分析0.5、5、10、15、20 min時小鼠心電圖，得到各組小鼠各階段ST段變化值。

2.4 血清CK、LDH檢測

上述心電圖檢測完成后，立即眼球取血，室溫凝置2 h后，低溫冷凍離心機3000 r·min－1，4℃離心10 min，取上清液，按CK和LDH試劑盒說明書檢測其相應水平。

2.5 統計學處理

應用SPSS 23.0軟件進行統計學處理，采用單因素方差分析（One Way ANOVA），選擇最小顯著差法（LSD），對各組均數進行兩兩比較。結果用均數±標準差（±s）表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠行為學的影響

高架十字迷宮結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠進入開放臂次數和滯留時間顯著降低（P＜0.05），而各給藥組小鼠較模型組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），以養心生脈顆粒中劑量組升高最為顯著（見表1）。

表1 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠高架十字迷宮的影響( ±s)Tab 1 Effect of Yangxin Shengmai granules on the elevated plus maze in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

表1 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠高架十字迷宮的影響( ±s)Tab 1 Effect of Yangxin Shengmai granules on the elevated plus maze in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the blank group，*P＜0.05；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別 n OE占比/% OT占比/%空白組 12 44.16±12.26 26.09±12.87模型組 12 28.09±12.56* 11.84±8.36*養心生脈顆粒低劑量組 12 42.27±17.51# 26.59±13.74#養心生脈顆粒中劑量組 12 47.45±13.13## 31.88±19.70##養心生脈顆粒高劑量組 10 43.42±21.40# 23.16±22.04陽性藥組 12 41.76±15.12## 24.30±10.30#

明暗箱實驗結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠明箱停留的次數和時間均降低，各給藥組較模型組相比有升高的趨勢，但效果較模型組均不顯著（見表2）。

表2 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠明暗箱的影響( ±s)Tab 2 Effect of Yangxin Shengmai granules on the light-dark box in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

表2 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠明暗箱的影響( ±s)Tab 2 Effect of Yangxin Shengmai granules on the light-dark box in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

注：與模型組比較，#P＜0.05。Note：Compared with the model group，#P＜0.05.

組別 n 進入明箱的時間/s進入明箱的次數/次空白組 12 159.27±14.35 27.25±6.40模型組 12 137.70±38.29 24.50±8.29養心生脈顆粒低劑量組 12 147.58±36.77 22.67±9.79養心生脈顆粒中劑量組 12 160.01±27.23 26.33±7.37養心生脈顆粒高劑量組 10 153.96±35.42 22.90±3.65陽性藥組 12 173.34±67.84# 16.00±8.69

曠場實驗結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠總路程顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，養心生脈顆粒中劑量組和陽性藥組小鼠的總路程顯著升高（P＜0.01），模型組小鼠進入中心區域的次數和時間較空白組減少，養心生脈顆粒低劑量及陽性藥組小鼠進入中心區域的次數和時間較模型組增加，但差異無統計學意義（見表3及圖1）。

圖1 各組大鼠運動軌跡圖Fig 1 Movement track of all groups

表3 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠曠場活動的影響( ±s)Tab 3 Effect of Yangxin Shengmai granules on the open field activity in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

表3 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠曠場活動的影響( ±s)Tab 3 Effect of Yangxin Shengmai granules on the open field activity in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01；compared with the model group，##P＜0.01.

組別 n 總路程/cm 進入中心區域的時間/s 進入中心區域的次數/次空白組 12 1906.18±426.06 15.54±8.94 13.92±6.92模型組 12 1378.07±419.31** 14.59±9.32 9.58±5.28養心生脈顆粒低劑量組 12 1314.75±302.84 18.64±17.76 11.33±8.27養心生脈顆粒中劑量組 12 1823.14±302.07## 13.66±8.52 12.50±6.64養心生脈顆粒高劑量組 10 1648.81±302.09 9.70±8.25 8.50±6.65陽性藥組 12 1807.98±389.37## 15.00±6.73 13.08±5.36

3.2 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠心電圖的影響

心電圖結果顯示，模型組小鼠心電圖ST段逐漸增大，15～20 min時ST段變化值大于0.05 mV。在注射ISO 5～20 min時，不同劑量給藥組均能顯著抑制ISO誘導的心電圖ST段抬高（P＜0.05，P＜0.01）（見表4）。

表4 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠心電圖的影響( ±s)Tab 4 Effect of Yangxin Shengmai granules on ECG in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

表4 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠心電圖的影響( ±s)Tab 4 Effect of Yangxin Shengmai granules on ECG in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

注（Note）：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01（Compared with the model group，*P＜0.05，**P＜0.01）。

組別 n 不同時間ST段抬高程度/mV 0.5 min 5 min 10 min 15 min 20 min模型組 9 0.0798±0.0384 0.1200±0.0319 0.1478±0.0384 0.1529±0.0438 0.2033±0.0590養心生脈顆粒低劑量組 12 0.0573±0.0191 0.0750±0.0177** 0.0963±0.0297** 0.1092±0.0362* 0.1223±0.0411*養心生脈顆粒中劑量組 12 0.0610±0.0149 0.0812±0.0316** 0.0913±0.0374** 0.1043±0.0458* 0.1208±0.0546*養心生脈顆粒高劑量組 10 0.0752±0.0382 0.0892±0.0442* 0.0972±0.0454** 0.1288±0.0699 0.1629±0.0985陽性藥組 12 0.0567±0.0150 0.0667±0.0142** 0.0810±0.0177** 0.0947±0.0397* 0.1325±0.0866*

3.3 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠LDH和CK活力的影響

心肌酶譜結果顯示，與空白組相比，模型組小鼠血清LDH、CK活力顯著升高（P＜0.01），養心生脈顆粒各給藥組小鼠LDH均降低，以養心生脈顆粒低劑量組LDH降低最為顯著（P＜0.01），各給藥組CK活力均顯著降低，以養心生脈顆粒中劑量組CK降低最為顯著，且與陽性藥組水平相當（P＜0.01）（見表5）。

表5 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠LDH和CK活力的影響( ±s)Tab 5 Effect of Yangxin Shengmai granules on the serum LDH and CK content in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

表5 養心生脈顆粒對ISO致心肌缺血模型小鼠LDH和CK活力的影響( ±s)Tab 5 Effect of Yangxin Shengmai granules on the serum LDH and CK content in myocardial ischemia model mice induced by ISO ( ±s)

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。Note：Compared with the blank group，**P＜0.01；compared with the model group，#P＜0.05，##P＜0.01.

組別 n LDH/（U·L－1）CK/（U·mL－1）空白組 12 3159.92±380.37 2.23±0.73模型組 12 3732.18±219.85** 5.06±0.66**養心生脈顆粒低劑量組 12 3144.51±276.89## 3.88±0.60##養心生脈顆粒中劑量組 12 3483.62±472.04# 2.60±0.87##養心生脈顆粒高劑量組 10 3410.40±248.65# 2.91±0.76##陽性藥組 12 3344.89±394.46## 2.39±0.96##

4 討論

近年來，隨著生物-心理-社會醫學模式的發展，焦慮、抑郁等負性情緒障礙在心血管疾病的發生發展中越來越受到關注。臨床上，患者由于疾病癥狀反復、長期服藥帶來的藥物不良反應以及治療費用高等問題，心理負擔加重，長期處于壓力刺激下，容易出現焦慮、抑郁等心理問題。嚴重焦慮、抑郁不僅會導致患者病情反復、療效欠佳，影響患者生活質量，而且會增加心血管不良事件發生的風險[9]。心血管疾病早期自主神經主要表現為副交感神經興奮下降，交感神經興奮性上升，后期自主神經失衡進展為副交感神經的慢性、持續性損傷過程，而焦慮可引起交感神經活動增加，加重平衡向交感系統傾斜，從而使冠狀動脈發生痙攣、狹窄，使心率變異性降低[10]，同時焦慮可促使機體處于應激狀態，增加兒茶酚胺類激素的釋放，作用于腎上腺素能α和β受體，可增加血小板聚集，降低心肌造血能力，而心肌缺血缺氧可激活交感神經，導致大量兒茶酚胺進入循環系統，使機體代謝紊亂，神經內分泌失調[11-12]。

目前建立心肌缺血伴焦慮模型多采用結扎冠狀動脈左前降支結合慢性不可預見性刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）的復合模型，該模型手術操作難度大，病死率高，加之CUMS實驗方法多樣，實際操作困難，方法選擇與實驗強度沒有統一標準，若強度較大，容易造成動物物理性損傷，增加模型動物病死率，同時模型過重，可能影響藥物作用效果[13]。兒茶酚胺類藥物ISO誘導小鼠心肌缺血模型是評價藥物對心肌缺血損傷作用的經典模型之一[14]，此外，據報道，經過ISO刺激，能夠模擬慢性壓力狀態下兒茶酚胺類激素釋放，使小鼠產生焦慮樣行為，其行為學表現與CUMS小鼠一致，此造模方法簡單易操作，能夠較好地模擬心肌缺血患者伴焦慮的臨床特征，避免復合模型中操作多樣化、難度較大、操作強度無標準等特點[15]，故采用外源性兒茶酚胺類藥物ISO造模，構建心肌缺血伴焦慮模型，為后續臨床及基礎研究提供了一種新思路。

高架十字迷宮實驗、明暗箱實驗和曠場實驗是研究動物焦慮樣行為較為成熟經典的方法，是判斷焦慮動物模型建立成功的主要手段[16]。本實驗行為學結果發現，ISO誘導心肌缺血模型小鼠在高架十字迷宮中進入開放臂次數和滯留時間，以及在曠場實驗中運動軌跡總路程均顯著降低，且在曠場實驗中心區域以及明暗箱實驗中明箱停留的次數和時間均有降低的趨勢，表明ISO誘導心肌缺血模型小鼠表現出顯著地焦慮樣行為，經養心生脈顆粒預處理后，小鼠進入開放臂、明箱和中心區域的次數和時間、曠場運動軌跡總路程的增加均可反映小鼠焦慮水平降低，探究行為活動增加。

ISO為人工合成的β受體強效激動劑，大劑量應用能夠使交感神經過度興奮，增加心臟負荷和外周阻力，導致心臟供血不足，心肌發生不可逆性缺血性損傷[14]。β-腎上腺素能受體激活不僅會增加心率，還會增加左心室收縮力，從而刺激心臟的活動[17]，通過加速心率，ISO會引起左心室心內膜下心肌灌注損傷，導致繼發性心內膜下心肌嚴重缺血造成心肌細胞損害，心電圖表現為ST段抬高或壓低及T波改變，正常心電等電位線無明顯的正向或負向偏移，而心肌缺血狀態下的異常電流可引起缺血部位ST段偏移，因此，ST段的偏移程度可以反映心肌缺血及損傷的程度，是用于評價心肌缺血變化的敏感指標[18-19]。本實驗結果發現，ISO組小鼠心電圖ST段偏移程度逐漸增大，15～20 min時，ST段變化值大于0.05 mV，提示心肌缺血模型建立成功。經養心生脈顆粒干預后能顯著抑制ISO誘導的心電圖ST段抬高，有效改善心肌缺血性損傷。

ISO誘導心肌缺血與心肌細胞膜通透性改變有關，兒茶酚胺類脂質過氧化產物可對心肌細胞膜造成不可逆性損傷，使細胞膜的功能和完整性喪失，導致LDH及CK等心肌酶從組織滲透到血液中[20]，LDH和CK特異性較高，少量心肌組織損傷或壞死都會引起血清LDH和CK活性水平升高，故血清中CK和LDH活性增加對評判心肌損傷具有重要意義[21]。本研究發現，養心生脈顆粒預處理可有效逆轉ISO誘導心肌缺血小鼠血清心肌酶CK和LDH的升高，提示養心生脈顆粒對ISO所致小鼠心肌缺血損傷具有保護作用。

綜上，養心生脈顆粒對ISO誘導小鼠心肌缺血具有保護作用，同時能夠改善其焦慮樣行為。