山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚復(fù)方組合物的體內(nèi)降血脂作用

李 瑩，吳莎莎，曹璨，徐建文，劉影

（哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，黑龍江哈爾濱 150001）

血脂異常（Dyslipidemias），又稱高脂血癥，是指血漿中的脂質(zhì)成分和含量發(fā)生改變的一種代謝性疾病。通常表現(xiàn)為血清總膽固醇（TC）和（或）甘油三酯（TG）升高，也包括高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）降低或低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）升高。2018 年發(fā)表的中國(guó)慢性病及危險(xiǎn)因素監(jiān)測(cè)研究顯示，中國(guó)18 歲以上成人中高總膽固醇、高甘油三酯、低HDLC、高LDL-C 患病率分別達(dá)到了6.9%、13.8%、20.4%、8.1%。目前臨床上大多采用西藥治療，其療效快，但易產(chǎn)生惡心、腹脹等不良反應(yīng)，長(zhǎng)期使用還會(huì)造成肝腎損傷。因此，開發(fā)更加安全無毒副作用的降脂產(chǎn)品逐漸成為新的趨勢(shì)。

山楂是我國(guó)特有的藥果兼用樹種，運(yùn)用高通量代謝組學(xué)的技術(shù)，Hu 等對(duì)高脂血癥大鼠脂肪組織的代謝變化進(jìn)行了非靶向分析，發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)高脂飲食時(shí)許多內(nèi)源性分子發(fā)生改變，而在山楂提取物干預(yù)后恢復(fù)；烏梅作為一種傳統(tǒng)補(bǔ)益中藥，其葉提取物可以降低高脂飲食誘導(dǎo)的糖尿病小鼠血清TG 水平；葡萄皮中含有白藜蘆醇、單寧、花青素等物質(zhì)，可以通過調(diào)節(jié)脂肪酶活性、增加抗氧化能力、減少過渡金屬以及自由基來改善血脂異常；枸杞中的枸杞多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)大鼠的腎臟損傷及脂質(zhì)沉淀具有保護(hù)作用，其果實(shí)中的花青素可以通過改善小鼠的炎癥和氧化應(yīng)激水平來改善高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗；桑葚提取物可以通過調(diào)節(jié)高脂飲食大鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)來減輕內(nèi)皮功能障礙，從而改善血脂異常。同時(shí)以上食物或藥物均屬于入藥典的食藥兼用品或食物，安全無毒，適合長(zhǎng)期服用。目前，國(guó)內(nèi)以山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚為復(fù)合原料的保健食品的研究尚未報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)首次對(duì)山楂、烏梅、葡萄皮等食物或藥物進(jìn)行科學(xué)組方，制備出一種具有輔助降血脂功能保健食品，并通過建立血脂異常大鼠模型，探究該組合物調(diào)節(jié)血脂的作用，以期提供一種更為安全，無毒副作用的調(diào)節(jié)血脂的新思路，并為其使用提供初步指導(dǎo)，進(jìn)一步為新型降脂保健食品的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠 50 只，體重200±20 g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；在SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心（屏障環(huán)境）飼養(yǎng)（許可證號(hào)：SYXK（黑）2011007），溫度21～23 ℃，濕度55%～58%；試驗(yàn)動(dòng)物所用的清潔級(jí)飼料 北京科澳協(xié)力飼料有限公司（許可證號(hào)：SCXK（京）2009-0012）；其中維持飼料配方：粗蛋白≥18%，粗脂肪≥4%，粗纖維≤5%，粗灰分≤8%，鈣1.0%～1.8%，總磷0.6%～1.2%，水分≤10%；模型飼料配方：在維持飼料中添加20%蔗糖、15%豬油、1.2%膽固醇、0.2%膽酸鈉，適量的酪蛋白、磷酸氫鈣、石粉等，除了粗脂肪外，模型飼料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、鈣、磷、鈣：磷均要達(dá)到維持飼料的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)；山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚 哈爾濱世一堂藥店。

動(dòng)物天平、電子天平 沈陽龍騰電子有限公司；Allegra64R 低溫高速離心機(jī) Beckman 公司；550 nm 酶標(biāo)儀 BIO-RAD 公司；電熱恒溫水浴鍋上海精宏醫(yī)療器械廠；TC、TG、LDL-C、HDL-C 試劑盒及脂蛋白脂肪酶、肝脂酶盒 北京中生生物工程高技術(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 受試樣品制備及劑量設(shè)計(jì) 取山楂40 重量份、烏梅40 重量份、葡萄皮30 重量份、枸杞30 重量份、桑葚20 重量份，此復(fù)方的配制比例根據(jù)本研究團(tuán)隊(duì)前期配方優(yōu)化研究確定。將各原料清洗去雜，60 ℃下干燥5 h，干燥后磨粉，過4 號(hào)篩混合均勻，輻照殺菌即得，得到的受試物為棕色粉末。感官檢查依據(jù)GB 16740-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 保健食品》，取適量受試物置于白色瓷盤中，在自然光下觀察色澤和狀態(tài)，嗅其氣味，用溫開水漱口，品其滋味，未見異常。分別以人體每日推薦劑量（0.05 g/kg·BW）的30 倍、10 倍、5 倍為高劑量組（1.5 g/kg·BW）、中劑量組（0.5 g/kg·BW）和低劑量組（0.25 g/kg·BW）。

取150 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.15 g/mL 的溶液，用于高劑量組給藥；取50 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.05 g/mL 的溶液，用于中劑量組給藥；取25 g 受試物粉末，加蒸餾水至1000 mL，配成0.025 g/mL 的溶液，用于低劑量組給藥。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 屏障系統(tǒng)下適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分成2 組，10 只大鼠給予維持飼料作為空白對(duì)照組，40 只給予模型飼料作為模型組。每周稱量體重1 次。模型組給予模型飼料2 周后，空白對(duì)照組和模型組大鼠不禁食采血（尾部），采血后盡快分離血清，測(cè)定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）水平。根據(jù)TC、TG 水平將模型組40 只動(dòng)物隨機(jī)分成4 組，即高、中、低劑量組（1.5、0.5、0.25 g/kg·BW）和模型對(duì)照組，每組10 只。分組后3 個(gè)劑量組每天按照10 mL/kg·BW 經(jīng)口給予受試樣品，空白對(duì)照組和模型對(duì)照組同時(shí)給予同體積的蒸餾水；空白對(duì)照組繼續(xù)給予維持飼料，模型對(duì)照組及三個(gè)劑量組繼續(xù)給予模型飼料。動(dòng)物自由攝食及飲水，每周記錄動(dòng)物體重。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定 連續(xù)灌胃30 d 后，于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不禁食采血，采血后盡快分離血清，按照試劑盒操作步驟，測(cè)定血清TC、TG、LDL-C、HDL-C 水平。采血后處死，立即取出并稱重肝組織，測(cè)定肝臟系數(shù)。取部分肝組織勻漿，按照試劑盒操作步驟，測(cè)定肝脂肪酶（HL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）活性。取肝右葉，10%福爾馬林固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠肝臟脂肪變性程度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。各組間均數(shù)比較進(jìn)行單因素方差分析，組間比較使用LSD 事后檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試物對(duì)大鼠體重的影響

由表1 可見，實(shí)驗(yàn)前及造模后，各劑量組與模型對(duì)照組相比，大鼠體重均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，所有組動(dòng)物生長(zhǎng)、活動(dòng)正常，各劑量組動(dòng)物與模型對(duì)照組相比體重?zé)o顯著性差別（>0.05）。

表1 受試物對(duì)大鼠體重的影響（，n=10）Table 1 Influence of the test substance on the body weight of rats (,n=10)

2.2 受試物對(duì)大鼠血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的影響

由表2 可見，模型對(duì)照組的血清TC（<0.05）和TG 水平始終高于空白對(duì)照組，說明高脂模型是成功的。血清總膽固醇是血液中各脂蛋白所含膽固醇的總和，過高的TC 是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病等心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一；血清TG 升高常見于代謝綜合癥，研究顯示輕度或中度TG 升高會(huì)增加患冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量受試物干預(yù)30 d 后，高、中劑量組血清的TC 與模型對(duì)照組相比分別下降了28.27%、16.35%，且差異顯著（<0.05）；高、中劑量組血清TG 與模型對(duì)照組比分別下降了27.91%、15.12%，且差異顯著（<0.05），說明該組合物可以起到調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝的作用。血液中的TC、TG 需要與載脂蛋白結(jié)合進(jìn)行運(yùn)輸。LDL 是膽固醇含量最高的脂蛋白，同時(shí)也是導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的因素；HDL 則被證實(shí)能將外周組織的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟進(jìn)行分解代謝，提示了其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。高、中劑量組血清的HDL-C 與模型對(duì)照組相比分別上升了65.72%、41.30%，且差異極顯著（<0.01），高、中劑量組血清的LDL-C 與模型對(duì)照組相比分別下降了40.28%、15.28%，且差異顯著（<0.05），說明該組合物可以調(diào)節(jié)血脂并抑制脂質(zhì)的沉積，進(jìn)而降低動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。Han 等通過給予肝損傷小鼠山楂果皮提取物，發(fā)現(xiàn)其血清TG、TG、LDLC 水平下降，HDL-C 水平上升，Mahmoudi 等也發(fā)現(xiàn)葡萄皮與葡萄籽提取物可以降低TC 水平，提高HDL-C 水平，這也與本文的研究結(jié)果相似。以上結(jié)果表明，本研究將這些食物或藥物進(jìn)行科學(xué)組方，得到的組合物具有一定的調(diào)節(jié)血脂作用，且各組分均屬于藥食同源的中藥，更兼顧了使用的安全性、規(guī)范性及方便性。

表2 受試物對(duì)大鼠血清總膽固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、血清低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的影響（，n=10）Table 2 Effects of test substances on serum total cholesterol,serum triglyceride,serum high-density lipoprotein cholesterol and serum low-density lipoprotein cholesterol in rats (,n=10)

2.3 受試物對(duì)大鼠肝臟系數(shù)和肝酯酶（HL）、脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的影響

肝臟系數(shù)為肝臟重量與體重的比值，由表3 可見，以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，除空白對(duì)照組外，各組肝臟系數(shù)無明顯差異（>0.05），但各劑量組與模型對(duì)照組相比有一定的下降趨勢(shì)，提示該組合物可能對(duì)于緩解大鼠肝臟脂肪堆積有一定作用。

表3 受試物對(duì)大鼠肝臟系數(shù)的影響（，n=10）Table 3 Effect of test substance on liver coefficient of rats(,n=10)

肝脂肪酶（HL）是一種主要由肝細(xì)胞產(chǎn)生的脂肪分解酶，在HDL 代謝中起重要作用。HL 不僅能水解HDL 中的甘油三酯和磷脂，還能刺激肝細(xì)胞對(duì)HDL-C 的攝取。脂蛋白脂肪酶（LPL）則是甘油三酯水解的限速酶，負(fù)責(zé)分解血液中的甘油三酯，同時(shí)還以不同方式促進(jìn)不同組織的脂質(zhì)和能量代謝。HL 及LPL 的活性降低會(huì)導(dǎo)致HDL-C 水平降低以及TG 水平上升，引起高脂血癥。由表4 可見，以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，高劑量組的HL、LPL 活性與模型對(duì)照組相比極顯著升高（<0.01），提示該組合物可能通過提高HL 和LPL 活性加速脂質(zhì)代謝，從而起到調(diào)節(jié)血脂的作用。此外，本研究結(jié)果顯示，該組合物在低、中劑量時(shí)，對(duì)HL 及LPL 活性影響較小，提示其通過提高酶活性改善血脂代謝的作用可能需要在較為充足的劑量范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)。

表4 受試物對(duì)大鼠肝酯酶（HL）和脂蛋白脂肪酶（LPL）活性的影響（，n=10）Table 4 Effects of test substances on rat liver esterase and lipoprotein lipase activities (,n=10)

2.4 受試物對(duì)大鼠肝組織病理形態(tài)的影響

由圖1 可見，空白對(duì)照組肝細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞內(nèi)基本無脂滴分布。模型對(duì)照組肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)嚴(yán)重的脂變，且脂滴較大，說明高脂模型是成功的，造模大鼠的肝臟內(nèi)存在脂肪堆積現(xiàn)象。而以1.5、0.5、0.25 g/kg·BW 劑量的受試物給予大鼠灌胃30 d 后，與模型對(duì)照組比，高、中劑量組脂滴空泡明顯減少、脂滴泡縮小，低劑量組則略微減輕。肝臟吸收血液中的脂肪酸，并將其酯化為中性脂肪，而肝脂肪變通常是由于脂蛋白合成障礙等原因脂肪運(yùn)輸障礙，或?qū)χ纠孟陆翟斐傻模虼嗽摻Y(jié)果提示了組合物具有一定代謝及轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪的作用。

圖1 HE 染色各組大鼠肝組織病理形態(tài)（100×）Fig.1 Pathological morphology of rat liver tissues in each group by HE staining (100×)

3 結(jié)論與討論

血脂異常是心血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，尤其與動(dòng)脈粥樣硬化息息相關(guān)。一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查顯示，2010 年我國(guó)45 歲及以上人群的血脂異?；疾÷蔬_(dá)到了42.84%，但其知曉率、治療率和控制率僅為20.27%、14.41%、4.94%。研究表明，植物性保健食品中含有的許多生物活性成分，如類黃酮、生物堿、多糖、多酚等均具有調(diào)節(jié)血脂的作用。而傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中部分中藥屬藥食同源中藥，既具有調(diào)節(jié)血脂的作用，同時(shí)更兼顧了使用的安全性、規(guī)范性及方便性，提示可以將這些藥物用于血脂異常的日常保健及預(yù)防。

本實(shí)驗(yàn)首次將山楂、烏梅、葡萄皮、枸杞、桑葚這些藥物或食物進(jìn)行科學(xué)配比，制備出一種具有輔助降血脂功能保健食品。通過構(gòu)建高脂大鼠模型，探究該組合物的調(diào)節(jié)血脂作用。研究結(jié)果表明，該組合物能降低高、中劑量組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯，低密度脂蛋白膽固醇水平，提高血清高密度脂蛋白膽固醇水平，提高肝酯酶、脂蛋白脂肪酶活性，改善肝細(xì)胞變性，具有調(diào)節(jié)血脂的作用。推測(cè)該組合物輔助調(diào)節(jié)血脂的機(jī)制可能為：該組合物中，山楂、烏梅及葡萄皮主要起到抗氧化的作用，調(diào)節(jié)機(jī)體氧化應(yīng)激水平，抑制高脂飲食誘導(dǎo)的血管炎癥，這種作用可能與山楂提取物的主要成分山楂黃酮、葡萄皮中富含的多酚、花青素及烏梅中所含的有機(jī)酸有關(guān)。與本文的研究結(jié)果相似，Shatoor 等發(fā)現(xiàn)，山楂提取物可以通過抗氧化機(jī)制及調(diào)節(jié)血清氧化低密度脂蛋白的水平；鄧婉婷等研究了烏梅總有機(jī)酸提取物的抗氧化效果，結(jié)果表明其對(duì)DPPH 有較強(qiáng)的清除能力，提示了烏梅的抗氧化的能力；而葡萄皮中富含的多酚可以通過調(diào)節(jié)胰島素敏感性和GLUT4 表達(dá)、預(yù)防骨骼肌和脂肪組織中的氧化應(yīng)激來對(duì)肥胖和高脂飲食引起的相關(guān)代謝紊亂產(chǎn)生有益影響。同時(shí)，組合物中添加了枸杞、桑葚，這兩種組分均具有減輕內(nèi)臟脂質(zhì)堆積的作用。現(xiàn)代藥理學(xué)證明，枸杞中的枸杞多糖作為一種潛在益生元，可以通過增加腸道菌群多樣性，尤其是降低了厚壁菌/擬桿菌的比例，改善脂質(zhì)代謝和腸道疾?。簧］毓麑?shí)可以防止食欲亢進(jìn)，降低高脂血癥帶來的體重增加和內(nèi)臟脂肪堆積，降低血清TG 及HDL-C 水平。該組合物中的成分相結(jié)合，從調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平、減輕內(nèi)臟脂質(zhì)堆積等方面共同作用，與傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中“寒溫并用，消補(bǔ)同施”的理念相符合，共同起到輔助調(diào)節(jié)血脂的作用。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這種組合物可以起到輔助調(diào)節(jié)血脂的作用，但其具體機(jī)制尚未明確。同時(shí)該結(jié)果與動(dòng)物模型的造模嚴(yán)重程度及動(dòng)物個(gè)體差異有關(guān)，該組合物在人體中能否發(fā)揮同樣的作用，以及在未來推廣使用中可能存在的潛在問題都有待于進(jìn)一步的研究。綜上所述，本研究結(jié)果提供了一種更為安全無毒副作用的調(diào)節(jié)血脂新思路，并為其使用提供初步指導(dǎo)，進(jìn)一步為新型降脂保健食品的開發(fā)提供支持。