響應(yīng)面優(yōu)化雞油菌多酚的超聲輔助提取工藝及其抗氧化活性

胡棟寶 ，黃淑佩，祝曉慧，施偉兵

（1.玉溪師范學(xué)院化學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，云南玉溪 653100；2.玉溪市食品藥品檢驗(yàn)所，云南玉溪 653100）

雞油菌（）又名黃絲菌、杏菌，是一種外生菌根真菌，屬真菌界擔(dān)子菌綱雞油菌科雞油菌屬真菌。雞油菌富含多糖、酚類、揮發(fā)油、氨基酸、抗真菌蛋白等多種生理活性成分，是全球六大菌根性食用菌之一。雞油菌的食用與藥用價(jià)值都很高，具有明目、抗腫瘤、治療心血管疾病、抗病毒、抗氧化、抗菌等作用。多酚類化合物含有酚羥基，是雞油菌抗氧化活性的主要成分之一。

一般來(lái)說(shuō)，多酚的提取方法主要有傳統(tǒng)提取法和現(xiàn)代提取法兩種。傳統(tǒng)的提取方法有索氏提取、熱回流提取和浸漬提取，現(xiàn)代提取技術(shù)主要有微波輔助、超聲輔助和加速溶劑提取。傳統(tǒng)提取法具有耗時(shí)長(zhǎng)、能耗大、提取率低等缺點(diǎn)，超聲波輔助提取技術(shù)（ultrasound-assisted extraction，UAE）因其具有提取時(shí)間短、有機(jī)溶劑用量少、目標(biāo)成分提取率高等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越多地受到人們的關(guān)注。目前，關(guān)于雞油菌多酚的響應(yīng)面優(yōu)化提取分析的研究還鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取雞油菌中的多酚，并將結(jié)果與傳統(tǒng)的浸提法與索氏提取法作比較，通過(guò)超高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)UPLC-MS 分析鑒定雞油菌中所包含的單體多酚，采用體外DPPH自由基清除等三種試驗(yàn)進(jìn)一步探究了雞油菌體外抗氧化活性，旨在為該種食用菌資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞油菌 云南省玉溪市；福林酚試劑 國(guó)藥集團(tuán)；兒茶素、迷迭香酸、丁香酸、槲皮素、綠原酸、原兒茶酸、咖啡酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 北京盛世康普化工技術(shù)研究院；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）美國(guó)Sigma 公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純 西隴科學(xué)股份有限公司。

4500 QTRAP LC-MS 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀美國(guó)AB SCIEX 公司；TGL-10B 高速臺(tái)式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠；電子分析天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；臺(tái)式加熱超聲波清洗器 上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；UV-2700 紫外分光光度計(jì) 日本島津；TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī) 湘儀集團(tuán)；pH838 酸度計(jì) 希瑪儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雞油菌多酚的提取工藝流程及操作要點(diǎn) 在室溫下，將干燥粉碎至恒重的雞油菌樣品過(guò)20 目篩，放置?20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩７Q取一定量的雞油菌粉末，加入不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在超聲功率150 W 條件下，在不同的料液比、溫度、時(shí)間下進(jìn)行提取，在高速離心機(jī)中以6000 r/min 的速度離心10 min，從離心管上端取出無(wú)沉淀的上清液，即為雞油菌多酚提取液。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取0.5000 g 雞油菌粉末，固定條件料液比1:30 g/mL，超聲溫度，乙醇濃度50%，超聲時(shí)間20 min，分別考察料液比（1:20、1:25、1:30、1:35、1:40（g/mL））、超聲溫度（30、35、40、45、50 ℃）、乙醇濃度（20%、30%、40%、50%、60%）、超聲時(shí)間（10、20、30、40、50 min）對(duì)雞油菌多酚含量的影響，以上實(shí)驗(yàn)每組平行三次。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Design-Expert.12 軟件中的Box-Behnken 設(shè)計(jì)四因素三水平試驗(yàn)。以雞油菌多酚含量為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸優(yōu)化，找到最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors levels design of Box-Behnken test

1.2.4 雞油菌多酚含量的測(cè)定 精密稱取沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.0050 g，溶解定容，得濃度0.01 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述標(biāo)液1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mL 于25 mL 的比色管中，加入去離子水15.00 mL，分別加入0.3 mL 福林酚試劑，搖勻，靜置10 min，加入10%的NaCO溶液2.0 mL，定容，室溫下避光放置1 h，以不加標(biāo)液的去離子水15.00 mL 為空白對(duì)照，在760 nm 下測(cè)定吸光值，平行三次取平均值；以標(biāo)液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=88.156x+0.0038，=0.9994。取雞油菌多酚提取液0.3 mL于25 mL 比色管，分別加入10 mL 去離子水、0.3 mL福林酚試劑，靜置10 min，加入2.0 mL10%的碳酸鈉溶液，定容，避光靜置1 h，于760 nm 處測(cè)定吸光度值，計(jì)算雞油菌多酚含量。

雞油菌多酚含量(mg/g)=(C×V×N)/(M×1000)

式中C：雞油菌多酚的質(zhì)量濃度，mg/mL；V：提取液體積，mL；N：稀釋倍數(shù)；M：雞油菌粉末質(zhì)量，g。

1.2.5 不同方法提取雞油菌多酚的比較

1.2.5.1 超聲輔助提取法 在料液比1:32（g/mL）、提取溫度40 ℃、乙醇濃度40 %、超聲時(shí)間21 min優(yōu)化條件下提取雞油菌多酚，計(jì)算多酚含量。

1.2.5.2 浸泡提取法 分別稱取5.0000 g 雞油菌3 份，置于三個(gè)錐形瓶中，分別加入40%的乙醇溶液200 mL，搖勻，置于暗處，封上保鮮膜，反應(yīng)24 h，將混合液離心20 min 得到提取液，計(jì)算多酚含量。

1.2.5.3 索式熱回流提取 準(zhǔn)確稱取雞油菌3.0000 g，定性濾紙包好放入索式提取器中，加入120 mL 40%的乙醇溶液，加熱至95 ℃，加熱回流4 h 得提取液，計(jì)算多酚含量。

1.2.6 雞油菌多酚提取物成分分析 以沒(méi)食子酸、咖啡酸、槲皮素、迷迭香酸、原兒茶酸、綠原酸、丁香酸、兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品，以甲醇溶解配成濃度分別為0.515、0.510、0.515、0.520、0.515、0.530、0.520、0.500 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，8 種酚類化合物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（>0.99）。利用4500 QTRAP 三重四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀（AB SCIEX）對(duì)上述超聲輔助提取法優(yōu)化得到的雞油菌多酚提取物進(jìn)行分析測(cè)定，計(jì)算樣品中各種酚類化合物的含量。

1.2.7 雞油菌多酚抗氧化性測(cè)定

1.2.7.1 DPPH 自由基清除活性測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0.0200 g DPPH，定容，搖勻，得100 mmol∕L 溶液。將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品分別在不同濃度（0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）條件下，加入2.0 mL DPPH 溶液，避光靜置30 min，于517 nm 測(cè)定吸光度值A(chǔ)。分別移取剩余樣液2.0 mL，加入2.0 mL 40%的乙醇溶液，于517 nm 測(cè)定吸光度值A(chǔ)，以V作為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3 次。

DPPH自由基清除率(%)=[1?(A?A)/A]×100

1.2.7.2 ABTS自由基清除活性測(cè)定 將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品分別在不同樣品濃度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175 mg/mL）條件下，加入3.0 mL ABTS溶液，避光靜置6 min，于734 nm測(cè)定吸光度值A(chǔ)。分別移取剩余樣液2.0 mL，加入3.0 mL 40%的乙醇溶液，于734 nm 測(cè)定吸光度值A(chǔ)。以V作為陽(yáng)性對(duì)照，平行測(cè)定3 次。

ABTS自由基清除率(%)=[1?(A?A)/A]×100

1.2.7.3 鐵離子還原能力 將雞油菌多酚提取液干燥后的樣品于不同濃度（0.05、0.075、0.10、0.125、0.15、0.175、0.20 mg/mL）條件下分別加入2.0 mL pH6.6 磷酸緩沖溶液和2.0 mL 1%鐵氰化鉀溶液，于50℃水浴中加熱20 min，加入2.0 mL10%三氯乙酸溶液，加氯化鐵0.5 mL 溶液，避光靜置6 min 后于700 nm 處測(cè)定吸光度值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)雞油菌多酚含量的影響 由圖1 可知，在料液比1:20～1:40（g/mL）范圍內(nèi)，雞油菌多酚含量隨料液比增大而逐漸增大，當(dāng)料液比為1:30（g/mL）時(shí)，多酚含量達(dá)到最大，可能由于溶劑增多導(dǎo)致傳質(zhì)推動(dòng)力變大，雞油菌粉末與溶劑接觸面積增大，多酚溶出速率高。隨著料液比的增大，雞油菌多酚含量逐漸下降，可能由于多酚成分已大部分溶出，倘若繼續(xù)增加溶劑比例，會(huì)導(dǎo)致雜質(zhì)增多從而抑制了多酚的析出，使其含量減少。因此，選擇最佳料液比為1:30（g/mL）。

圖1 料液比對(duì)雞油菌多酚含量的影響Fig.1 Effect of ratio of solid-liquid on polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.2 超聲溫度對(duì)雞油菌多酚含量的影響 由圖2可知，在超聲溫度30～50℃范圍內(nèi)，雞油菌多酚含量隨超聲溫度的升高而逐漸增大，當(dāng)溫度達(dá)到40 ℃，多酚含量達(dá)到最大，隨后多酚含量逐漸下降，可能在一定范圍內(nèi)溫度的升高會(huì)加快分子間的運(yùn)動(dòng)程度，同時(shí)軟化樣品的細(xì)胞壁，繼而破壞其結(jié)構(gòu)組成，使細(xì)胞內(nèi)的多酚物質(zhì)析出，但是溫度太高會(huì)破壞多酚結(jié)構(gòu)從而影響其含量。因此，最佳超聲溫度選擇40 ℃。

圖2 超聲溫度對(duì)雞油菌多酚含量的影響Fig.2 Effect ofultrasonic temperature on polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.3 乙醇濃度對(duì)雞油菌多酚含量的影響 由圖3可知，在乙醇濃度20%～60%范圍內(nèi)，雞油菌多酚含量隨乙醇濃度增大而逐漸增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，其多酚含量達(dá)到最大,可能原因是不同濃度的乙醇溶液所具有的極性存在差異，對(duì)多酚的溶解度不同，因而濃度在20%～40%范圍內(nèi)多酚含量隨乙醇濃度的增大而增大，但如果濃度過(guò)高，會(huì)使脂溶性雜質(zhì)變多從而抑制多酚的溶出，導(dǎo)致其含量降低。因此，最佳乙醇提取濃度選擇40%。

圖3 乙醇濃度對(duì)雞油菌多酚含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)雞油菌多酚含量的影響 由圖4可知，在超聲時(shí)間10～50 min 范圍內(nèi)，雞油菌多酚含量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，并在20 min 時(shí)達(dá)到最大，20 min 后其含量逐漸下降，可能由于時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使氧氣有更多機(jī)會(huì)與多酚物質(zhì)發(fā)生氧化反應(yīng)從而使多酚含量減少。因此，選擇最優(yōu)超聲時(shí)間為20 min。

圖4 超聲時(shí)間對(duì)雞油菌多酚含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the polyphenols contents of Cantharelles cibarius

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 響應(yīng)面模型設(shè)計(jì)與分析 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，由Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以料液比、超聲溫度、乙醇濃度及超聲時(shí)間4 個(gè)因素，共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experiment design and results

對(duì)Design-Expert.12 軟件表中數(shù)據(jù)進(jìn)分析，建構(gòu)出提取條件和多酚含量間的二次多項(xiàng)式模型為Y=12.25+0.1308A+0.1358B?0.0250C+0.1817D+0.0275 AB+0.0.0275AC+0.0275AD?0.1550BC+0.0400BD?0.0225CD?1.98A?0.8131B?0.7918C?0.9843D。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度可由上式各系數(shù)絕對(duì)值大小反映：模型的二次項(xiàng)系數(shù)均是負(fù)數(shù)，其拋面開口朝下，有極大值點(diǎn)，因此可對(duì)其優(yōu)化評(píng)價(jià)。對(duì)上述模型展開方差分析，結(jié)果見表3。

通常情況下，回歸方程各因素的顯著性可通過(guò)值和值進(jìn)行檢驗(yàn)，以揭示各變量間的相互作用，<0.05 說(shuō)明建模成功。表3 表明，該模型呈極顯著（此時(shí)<0.0001），說(shuō)明該模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；失擬項(xiàng)0.1971>0.05，呈不顯著，說(shuō)明模型合適說(shuō)明該模型擬合度好、實(shí)驗(yàn)誤差小；決定系數(shù)=0.9797，表明試驗(yàn)研究的自變量（4 個(gè)單因素條件）與因變量（雞油菌多酚含量）的關(guān)系顯著；校正決定系數(shù)=0.9595，表明模型與試驗(yàn)較為可靠，可解釋95.95%響應(yīng)值變化。顯著性分析表明，一次項(xiàng)D 和二次項(xiàng)A、B、C、D對(duì)因變量影響極顯著（<0.01），一次項(xiàng)A、B 影響顯著（<0.05），其他交互項(xiàng)都無(wú)顯著影響（>0.05）。由值大小可知，各因素對(duì)樣液多酚含量的影響大致為：超聲時(shí)間（D）>溫度（B）>液料比（A）>乙醇濃度（C）。

表3 超聲提取法回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance of the constructed regression model by ultrasonic-assisted extraction

2.2.2 響應(yīng)曲面分析 三維響應(yīng)面圖是響應(yīng)值對(duì)各影響因子所構(gòu)成的曲面圖，可以直觀地判斷出不同影響因子交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響趨勢(shì)以及響應(yīng)值的變化范圍。根據(jù)多元回歸方程做出不同處理因素對(duì)雞油菌多酚含量的影響相應(yīng)三維響應(yīng)面圖。如圖5所示，響應(yīng)曲面均為開口向下的凸形曲面，說(shuō)明含量存在最大值。由圖5a 與圖5c 可知，時(shí)間與溫度曲面彎曲程度較大，說(shuō)明該因素對(duì)雞油菌中多酚的含量影響顯著。

圖5 兩因素交互作用對(duì)多酚含量影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface diagram of the interaction of two factors on the content of polyphenols

2.2.3 最優(yōu)提取工藝驗(yàn)證 由Design-Expert.12 求解回歸方程，得出最優(yōu)的雞油菌提取方案為：料液比1:32.48（g/mL）、提取溫度40.49 ℃、乙醇濃度39.64%、超聲時(shí)間21.02 min，在此條件下雞油菌多酚含量可達(dá)11.80 mg/g。考慮實(shí)際操作的局限性，確定實(shí)驗(yàn)方案為料液比1:32.48（g/mL）、提取溫度40 ℃、乙醇濃度40%、超聲時(shí)間21 min。在此條件平行測(cè)定三次，驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果的多酚含量為11.80 mg/g，與預(yù)測(cè)值接近，偏差較小，證實(shí)此模型可用來(lái)對(duì)雞油菌多酚成分進(jìn)行進(jìn)一步的提取及優(yōu)化。

2.2.4 超聲提取法與浸泡、索式熱回流兩種提取法的效率比較 為了比較超聲波輔助提取雞油菌多酚含量的優(yōu)勢(shì)，采取浸泡提取法與索式熱回流提取法作為對(duì)比。將雞油菌粉末在室溫下浸泡24 h 后，測(cè)定多酚含量為8.60 mg/g，此方法較為安全，不需控制溫度，缺點(diǎn)是所需時(shí)間較長(zhǎng)、多酚提取含量較低，可能是由于室溫浸取，溫度較低，分子熱運(yùn)動(dòng)較為緩慢，導(dǎo)致多酚溶出減少，提取率較低。在95 ℃條件下，采用索氏提取法提取4 h 后，測(cè)得多酚含量為3.60 mg/g，此方法的缺點(diǎn)是溫度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致酚類物質(zhì)的分解或者引起其他雜質(zhì)的溶解，間接導(dǎo)致酚類含量減低。因此，超聲輔助提取雞油菌多酚是一種高效的提取方法。

2.2.5 雞油菌多酚成分的質(zhì)譜分析 多酚類化合物分子結(jié)構(gòu)中一般都含有酚羥基，具有抗氧化活性，為了進(jìn)一步研究云南雞油菌中的多酚的種類及含量，本研究通過(guò)超高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)UPLC-MS 雞油菌種8 種多酚單體。如圖6、圖7 及表4 所示，雞油菌多酚提取物中質(zhì)譜分析鑒定出的6 種單體多酚有原兒茶酸、丁香酸、迷迭香酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸、槲皮素。由表4 可知，雞油菌多酚提取物中沒(méi)食子酸含量最高，其次是咖啡酸，然后是丁香酸和原兒茶酸，分析所得到的這六種多酚化合物可能是雞油菌多酚提取物具有抗氧化活性的主要物質(zhì)。

表4 雞油菌樣品中酚類化合物含量測(cè)定結(jié)果（μg·g?1）Table 4 Polyphenols content in Cantharelles cibarius (μg·g?1)

圖6 8 種酚類標(biāo)準(zhǔn)品的XIC 圖Fig.6 XIC of 8 kinds of phenolic compounds

圖7 雞油菌多酚提取物中8 種酚類化合物的XIC 圖Fig.7 XIC of 8 kinds of phenolic compounds from Cantharelles cibarius

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 雞油菌多酚對(duì)DPPH 自由基的清除作用 由圖8 可知，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，隨著樣品濃度的增加，雞油菌多酚提取液對(duì)DPPH 自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)清除率到77.7%時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明雞油菌多酚對(duì)DPPH 自由基具有良好的清除效果。

圖8 雞油菌多酚對(duì)DPPH 自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on DPPH free radical

2.3.2 雞油菌多酚對(duì)ABTS自由基的清除作用 如圖9 所示，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，雞油菌多酚提取液對(duì)ABTS自由基的清除率也具有明顯的量效關(guān)系，在濃度0.13（mg/mL）時(shí)，清除率為98.8%時(shí)達(dá)到最大，說(shuō)明雞油菌多酚樣液具有較強(qiáng)的清除ABTS自由基的能力。

圖9 雞油菌多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用Fig.9 Scavenging effect of polyphenols from Cantharelles cibarius on ABTS+ free radical

2.3.3 雞油菌多酚的Fe還原能力 多酚能使反應(yīng)體系中Fe還原成Fe，溶液由黃色變成不同程度的藍(lán)色，還原能力越強(qiáng)，吸光度越大。由圖10 可知，在0.05～0.20 mg/mL 質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，雞油菌多酚提取物和抗壞血酸吸光度逐漸增大，表現(xiàn)出良好的還原能力。還原能力可延緩或終止自由基反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示雞油菌多酚提取物的抗氧化活性良好，多酚質(zhì)量濃度越高還原能力越強(qiáng)。

圖10 雞油菌多酚的Fe3+還原能力Fig.10 Fe3+ reduction ability of polyphenols from Cantharelles cibarius

3 結(jié)論

本文通過(guò)超聲乙醇提取法得出雞油菌中多酚的最佳提取條件：料液比1:32（g/mL）、超聲溫度40℃、乙醇濃度40%、超聲時(shí)間21 min，多酚的含量為11.80 mg/g，各因素對(duì)樣液多酚含量的影響順序?yàn)椋撼晻r(shí)間（D）>超聲溫度（B）>料液比（A）>乙醇濃度（C）。通過(guò)超高效液相色譜UPLC-MS 質(zhì)譜技術(shù)分析鑒定出雞油菌中包含6 種單體多酚原兒茶酸、丁香酸、迷迭香酸、沒(méi)食子酸、咖啡酸、槲皮素。體外抗氧化活性研究表明，雞油菌多酚對(duì)DPPH 自由基、ABTS自由基具有較強(qiáng)的清除活性，對(duì)Fe還原能力也較強(qiáng)。研究結(jié)果表明超聲波輔助提取方法一種簡(jiǎn)單快速高效的雞油菌多酚提取方法。