豬血管緊張素轉換酶2 的分離純化及性質研究

劉維維，張凌晶，紀夢雅，翁凌，張志剛，劉光明，曹敏杰,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.肉食品安全生產技術國家重點實驗室，福建廈門 361100）

血管緊張素轉換酶2（ACE2，EC 3.4.17.23）是血管緊張素轉換酶（ACE，EC 3.4.15.1）的同源酶，兩者共同參與血壓調節系統的穩定平衡。ACE2 對多種生物活性肽具有水解活性，并優先裂解以Pro-X 結尾的肽段的末端氨基酸殘基（X 為疏水性氨基酸），如Ang II（DRVYIHPF）、Apelin-13（QRPRLSHKGPMPF）等。Ang II 是高血壓系統中的關鍵調節因子之一，ACE2 可水解Ang II 生成Ang（1-7），進而作用于G 蛋白偶聯受體Mas 受體，從而發揮舒張血壓、抗氧化損傷、抗炎等作用，對抗平衡由ACE-Ang Ⅱ-AT1 受體系統介導的升壓效應，并發揮減緩腸道內的炎癥反應及氧化損傷等功能。除此之外，ACE2 還可協調腸道內氨基酸的轉運和葡萄糖的穩態。

近年來，隨著對ACE2 在高血壓系統中作用研究的深入，關于食源性降壓產品的研究不再局限于ACE 抑制肽，ACE2 激活肽的研究日益受到關注。Liao 等發現，蛋清蛋白中提取的一種可顯著降低原發性高血壓大鼠（Spontaneously Hypertensive Rats，SHRs）血壓的三肽IRW，其降壓途徑并非抑制ACE，而是通過上調ACE2 發揮降壓作用。這表明以激活ACE2 為目的開發降壓產品有望成為高血壓防治的新靶點。有研究發現，ACE2 激動劑氧雜蒽酮類化合物（Xanthenone，XNT）可與ACE2 結合，打開其相對封閉的構象使更多的底物進入，且能顯著降低原發性高血壓大鼠（SHRs）的血壓。這表明以激活ACE2 為靶點制備新型降血壓產品是一種新途徑，而食源性肽是ACE2 激活產品的良好來源。

ACE2 的組織分布廣泛，在腎臟、心臟、睪丸、腸道等組織均有表達，主要分布于冠狀動脈、腎血管內皮和腎小管內皮。前期的研究者通過分子生物學技術克隆并表達了人源、豬源以及牛源等動物的ACE2，而天然ACE2 由于含量低、純化難度大等問題，其分離純化以及性質研究鮮有報道。因此，本研究擬優化天然ACE 的純化方法，以豬腎實質為原材料分離純化豬ACE2 并對其酶學性質進行研究，為以ACE2 活性為靶點的食源性功能食品的開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮豬腎臟、胰、脾、大腸、小腸、胃、心、腦及肺組織 廈門銀祥食品有限公司，為排除個體差異，每個組織取樣三份，分別來源于三頭豬；DEAESepharose、HiTrap Phenyl Sepharose、HiTrap Q-Sepharose 層析柱 GE Healthcare 公司；熒光底物Mca-Ala-Pro-Lys（Dnp）-OH（MCA-APK）GLPBIO 公司；7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）Peptide Institute 公司；兔抗人ACE2 單克隆抗體 ABclonal 公司；兔抗-actin 單克隆抗體Cell Signaling Technology 公司；HRP 標記的羊抗兔IgG 抗體 Pierce 公司；SDS 標準蛋白 Fermentas 公司；PAS 染色試劑盒 Solarbio 公司；其他試劑均為國產分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

Avanti J-26SXP 高速冷凍離心機 美國Beckman公司；G:BOX 凝膠成像儀 英國Synegene 公司；Fluor ChemQ 化學發光成像儀 美國Alpha Innotech公司；Chirascan 圓二色譜儀 英國Applied Photophysics；M200 PRO 多功能酶標儀 奧地利Tecan公司；AKTA 蛋白及多肽純化裝置 美國GE Healthcare 公司；Nanodrop 100 微量蛋白核酸測定儀 美國Thermo Fisher Scientific 公司；JS-Power 600 電泳儀 中國培清科技。

1.2 實驗方法

1.2.1 豬不同組織前處理 豬的腎、心、肝、脾、肺等組織在?18 ℃下預凍24 h 后常溫流水解凍。每個組織共取15 g，洗去血水，用3 倍體積（w/v）的緩沖液A（50 mmol/L Tris-HCl，pH7.5）勻漿，而后加入0.7% Triton X-100（w/v）攪拌1 h，差速離心（0～8000×g，4 ℃，30 min）后取上清液，四層紗布過濾后的透過液即為樣液。

1.2.2 免疫印跡（Western blot）分析ACE2 在不同組織中的存在 取上述樣液，參考李婉玉等的方法進行實驗操作。選擇兔抗人ACE2 單克隆抗體（1:2000 稀釋）作為一抗，內參蛋白以兔抗-actin 單克隆抗體（1:10000 稀釋）作為一抗，HRP 標記的羊抗兔IgG（1:20000 稀釋）作為二抗。用Image J 軟件對圖像進行灰度分析。

1.2.3 豬腎實質ACE2 的分離純化

1.2.3.1 豬腎實質前處理 使用400 g 豬腎用于ACE2的分離純化，處理過程均在4 ℃下進行。具體方法參考1.2.1。

1.2.3.2 酸沉淀及硫酸銨鹽析 1.2.3.1 所得粗酶液用1 mol/L 鹽酸緩慢調pH 至4.2，于50 ℃水浴加熱20 min 后轉移至37 ℃水浴2 h，冰水冷卻后，離心（12000×g，4 ℃，30 min），四層紗布過濾后取透過液。透過液經終濃度2.1～2.7 mol/L（NH）SO鹽析，所得沉淀立即用少量的緩沖液A 溶解后置于透析袋中，以同緩沖液A 在4 ℃充分透析以除去（NH）SO，透析期間更換3 次相同緩沖液。

1.2.3.3 柱層析分離純化 透析后的粗酶液上樣于預先以緩沖液A 平衡的DEAE-Sepharose 陰離子交換柱，采用含0～0.4 mol/L NaCl（800 mL）的緩沖液A作線性梯度洗脫，柱層析期間保持流速為1 mL/min。收集酶活力高且雜蛋白相對較少的組分在緩沖液B（50 mmol/L Tris-HCl，pH8.5）中充分透析。透析后上樣于以緩沖液B 預先平衡的Q-HP（Q-High Performance）柱，依次用含0.125 mol/L（200 mL）、0.25 mol/L（220 mL）和0.5 mol/L NaCl（125 mL）的緩沖液B 進行梯度洗脫，柱層析期間保持流速為2 mL/min。收集酶活力較高的部分，選用30 kDa 濃縮管置換至緩沖液A 中，預先加入（NH）SO至終濃度為1.4 mol/L，上樣于Phenyl-HP（Phenyl-High Performance）柱，依次用含1.05 mol/L（20 mL）、0.70 mol/L（NH）SO（35 mL）的緩沖液A 進行洗脫，柱層析期間保持流速為2 mL/min。將活性組分收集進行SDS-PAGE 驗證純度，并使用Western blot 進行驗證，而后立即用于酶學性質分析。

1.2.4 ACE2 的活性測定 酶活力測定以MCAAPK 為底物，參照Sriramula 等的方法并略作修改，具體方法如下：在黑色酶標板中，將17.5 μL 待測酶液加入到80 μL 50 mmol/L Tris-HCl（pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 μmol/L ZnCl）中并混勻，立即加入2.5 μL 底物MCA-APK 使其終濃度為10 μmol/L。在酶標儀中37 ℃下避光反應30 min 后，立即在激發波長320 nm，發射波長405 nm 下測定反應所釋放產物的熒光強度，以7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）標準溶液對反應產物進行定量。

一個酶活力單位（U）定義為每分鐘釋放1 nmol AMC 所需的酶量。

1.2.5 蛋白含量測定 使用微量蛋白核酸測定儀測定蛋白樣品在280 nm 的吸光值，以標準濃度的牛血清白蛋白為對照。

1.2.6 ACE2 的LC-MS/MS 分析 純化過程中，對ACE2 的純度進行SDS-PAGE 分析。用考馬斯亮藍染液對最終純化的ACE2 凝膠進行染色，充分脫色后切膠回收目的蛋白條帶，用LC-MS/MS 進行氨基酸序列鑒定，該工作委托深圳市微納菲生物技術有限公司完成。

1.2.7 豬腎ACE2 酶學性質分析

1.2.7.1 溫度對ACE2 活性的影響 ACE2 最適溫度的測定：將適量的酶液在不同的溫度下（15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃）進行酶促反應，按照酶活檢測方法，測定酶活。

ACE2 熱穩定性的測定：將適量的酶液與50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液（pH7.0，含0.3 mol/L NaCl，10 μmol/L ZnCl）混合后，置于不同溫度下（0～70 ℃）孵育20 min，立即在冰水中冷卻，按照酶活檢測方法在37 ℃下測定ACE2 的剩余酶活力。

1.2.7.2 pH 對ACE2 活性的影響 ACE2 最適pH的測定：將適量的酶液在不同的pH 條件下（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）進行酶促反應，按照酶活檢測方法，在37 ℃下測定酶活。

ACE2 的pH 穩定性測定：將適量的酶液與不同pH 的緩沖液混合后，置于4 ℃孵育30 min，按照酶活檢測方法，在37 ℃，pH7.0 下測定ACE2 的剩余酶活力。

1.2.7.3 ACE2 的熱變性溫度分析 采用圓二色譜法（Circular dichroism，CD）分析熱變性和冷卻復性過程中ACE2 二級結構的變化。操作前將ACE2 酶液置換至不含鹽的緩沖液中，蛋白濃度為0.3 mg/mL，掃描溫度范圍為20～90 ℃，速率為0.5 ℃/min，以1 nm的光譜間隔從190～260 nm 對樣品進行測定。通過Global3 軟件對ACE2 的熱變性溫度Tm 進行預測。

1.2.7.4 金屬離子對ACE2 活力的影響 在ACE2酶液中，加入不同金屬離子（Zn、Fe、Ca、Ba、Cu、Cd、Na、Co、Mn）至終濃度為1 mmol/L。在4 ℃下孵育30 min 后，立即按照酶活檢測方法測定剩余酶活力。其中，對照組以50 mmol/L Tris-HCl（pH7.0）代替金屬離子溶液。

1.2.7.5 抑制劑對ACE2 活力的影響 將ACE2 與不同蛋白酶抑制劑（EDTA，1,10-Phenanthroline，Pepstatin A，AEBSF，Leupeptin，E-64，Benzamidine）在常溫下孵育30 min，然后測定其剩余酶活力。對照組不添加蛋白酶抑制。

1.2.7.6 PAS 染色法鑒定糖蛋白 將純化的ACE2上樣于10% 的SDS-PAGE，電泳后，按照PAS 染色試劑盒的說明對凝膠進行染色。

1.3 數據處理

采用Excel 2013 軟件對數據進行整理，應用GraphPad Prism 5 軟件進行繪圖，使用Adobe Illustrator CS5 處理圖像，所有實驗數據均重復3 次進行測定，并取其平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 ACE2 在豬不同組織中的分布

利用Western blot 法分析ACE2 在豬不同組織中的分布。如圖1，結果發現，ACE2 按蛋白表達水平從多到少依次為腎，小腸，肝，胃；在腦、肺、大腸、胰臟中幾乎沒有ACE2 的存在。王珊珊等通過RT-PCR 和免疫組化方法對仔豬不同組織中ACE2分布進行分析，結果顯示ACE2 mRNA 在仔豬腎臟、小腸及胃底中顯著表達，另外在十二指腸、空腸及結腸中表達量較高，與本研究從蛋白水平分析的結果相似。

圖1 ACE2 在豬不同組織中分布的免疫印跡分析Fig.1 Western blot analysis of ACE2 distribution in different tissues of porcine

2.2 ACE2 的分離純化與免疫印跡

在純化時選用Triton-X100 增加ACE2 溶解性，經酸沉淀和硫酸銨鹽析去除部分雜蛋白后得到ACE2 粗酶液。ACE2 粗酶液經DEAE-Sepharose陰離子交換柱初步純化，收集活性較高且雜蛋白較少的組分，經透析后上樣于Q-Sepharose 強陰離子交換柱，在0.25 mol/L NaCl 時目的蛋白被洗脫下來（圖2）。活性組份繼續上樣于Phenyl Sepharose 疏水柱，最終在0.7 mol/L（NH4）SO的洗脫部分酶活峰與蛋白峰重疊，獲得目的蛋白（圖2C）。SDS-PAGE 分析顯示，純化蛋白分子量為98 kDa（圖2D），Western blot表明抗ACE2 單克隆抗體能與該蛋白產生特異性反應（圖2E）。對ACE2 的純化結果如表1 所示，從400 g 豬腎實質中純化得到0.6 mg ACE2，得率為0.1%，純化倍數為149.8 倍（表1）。

表1 豬腎ACE2 純化結果Table 1 Purification of angiotensin converting enzyme 2 from porcine kidney

圖2 ACE2 的柱層析純化、SDS-PAGE 及免疫印跡分析Fig.2 Column chromatography purification,SDS-PAGE and Western blot analysis of ACE2

2.3 ACE2 的質譜鑒定

將純化得到的ACE2 蛋白條帶切膠回收，經胰蛋白酶酶切后得到的多肽樣品上樣于LC-MS/MS，共得到41 個肽段，含386 個氨基酸殘基。通過Uniprot 下載的Sus scrofa 蛋白數據庫進行檢索，得到的結果如圖3 所示，酶解后得到的41 個肽片段與豬的ACE2（NP_001116542.1）序列高度一致，表明純化的蛋白為豬ACE2。

圖3 純化ACE2 的液相色譜-串聯質譜分析Fig.3 LC-MS/MS analysis of the purified ACE2

2.4 ACE2 的酶學性質分析

2.4.1 最適溫度與熱穩定性 ACE2 的最適溫度為40 ℃（圖4A），該結果與多數哺乳動物體內的溫度為35～40 ℃相對應，表明ACE2 在該溫度附近能夠發揮其最高的酶活力。

當溫度在15～50 ℃時，ACE2 的酶活力較為穩定，相對酶活在90%以上，而當溫度升高至55 ℃時，ACE2 的相對酶活開始下降，到60 ℃時下降至15%左右，到70 ℃時幾乎完全喪失酶活，表明ACE2 的耐熱性較差（圖4A）。

2.4.2 最適pH 與pH 穩定性 ACE2 在pH7.0 時的活性最高，當pH 高于或低于7.0，ACE2 的相對酶活明顯下降，在pH10.0 時酶活基本喪失，表明ACE2在中性偏酸的環境中更宜發揮其活性（圖4B）。該結果與報道的在Sf9 昆蟲細胞中表達純化的重組人ACE2 的最適pH 為6.5 相似。

對ACE2 的pH 穩定性分析發現，當pH 在5.0～7.0 的范圍內，ACE2 的穩定性較好，相對酶活保持在80%以上，pH 為6.0 時ACE2 的活性最高。而當pH 上升至10.0 時ACE2 的相對酶活僅有50%左右，表明其在中性偏酸的環境相對穩定（圖4B）。

圖4 溫度（A）和pH（B）對豬腎ACE2 活性的影響Fig.4 Effect of temperature (A) and pH (B) on the activity of ACE2

2.4.3 ACE2 熱變性分析 為了研究溫度對豬ACE2二級結構的影響，對純化ACE2 進行圓二色譜掃描分析，掃描波長范圍為190～260 nm。如圖5 所示，通過Global 3 軟件對ACE2 的熱變性溫度（Tm）進行預測，其Tm 值為（67.5±0.1）℃，即當環境溫度在67.5 ℃附近時，ACE2 的氫鍵和范德華力會受到破壞，從而導致其構象開始發生變化（圖5A）。圖5B顯示了加熱前后以及回溫后ACE2 的結構變化，當溫度升高至90 ℃時，與天然狀態下即30 ℃時的二級結構對比有較大的差異，此時ACE2 的二級結構已經被破壞，當溫度回復至30 ℃時無法恢復至天然狀態下的結構，表明90 ℃加熱可導致ACE2 的不可逆變性。

圖5 圓二色譜法檢測溫度對ACE2 結構的影響Fig.5 Effect of temperature on the structure of ACE2 as detected by CD spectrum

2.4.4 金屬離子對ACE2 相對酶活的影響 金屬離子對于酶的表達和調控具有重要的作用，某些金屬離子對酶有催化作用，而一些金屬離子，如重金屬離子Cu、Pb等，在低濃度時會對某些酶產生抑制作用，高濃度時會使酶變性失活。表2 總結了不同金屬離子在同一濃度（1.0 mmol/L）下對ACE2 酶活的影響，其中Zn、Na、Co及Mn對ACE2 的酶活有一定的激活作用，Zn的激活作用最強。Cd對ACE2 的酶活有一定的抑制作用，Cu和Fe幾乎能完全抑制ACE2 的活性。

表2 金屬離子對ACE2 活性的影響Table 2 Effect of metal ions on the activity of ACE2

2.4.5 抑制劑對ACE2 活性的影響 如表3，金屬蛋白酶抑制劑EDTA，1,10-Phenanthroline 幾乎能完全抑制ACE2 的活力，而其他抑制劑如絲氨酸蛋白酶抑制劑AEBSF、Leupeptin 及Benzamidine，胃蛋白酶抑制劑Pepstatin A，半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64 對ACE2 的活力無明顯影響。這些結果反映了ACE2具備金屬蛋白酶特性，與Donoghue 等發現ACE2有潛在金屬蛋白酶鋅結合位點的結果類似。

表3 抑制劑對ACE2 活力的影響Table 3 Effect of inhibitors on ACE2 activity

2.4.6 糖蛋白鑒定 目前對于糖蛋白的鑒定通常采用PAS 染色法，即通過高碘酸與Schiff 堿的氧化還原反應形成明顯的紅色復合物進行鑒別。對ACE2進行PAS 染色鑒定是否為糖蛋白，結果如圖6 所示。ACE2（泳道3）與陽性對照二肽基肽酶（Dipeptidyl Peptidase Ⅳ，DPP-Ⅳ）（泳道1）同顯示為一條紅色條帶，而陰性對照牛血清白蛋白（Albumin from bovine serum，BSA）（泳道2）則不顯示紅色條帶，表明ACE2 是糖蛋白。蛋白質的糖基化，除了結構特征不明顯的O-糖基化外，還有結構特征為N-X-S（T）（X 代表任何一種氨基酸）的N-糖基化，而ACE2 中具有該結構特征的位點有多個（圖3）。

圖6 PAS 染色結果Fig.6 Result of PAS staining

3 討論

前期對ACE2 的研究工作中，Lin 等通過硫酸銨鹽析，Q-Sepharose，Phenyl-Sepharose，DEAESepharose，SP-Sepharose 和Superose HR 等多種柱層析結合的方法從人心臟左心室膜中分離純化出了ACE2 與整合素1 的復合物，分子量為130 kDa，但得率僅為0.0006%。該方法存在流程繁瑣、得率低等問題。為了建立更加有效的天然ACE2 純化方法，本研究利用免疫印跡法從蛋白水平探究了豬不同組織中ACE2 的分布差異。以ACE2 蛋白水平最高的腎臟為原材料優化條件，采用Triton-X100 增加ACE2溶解性，簡化了柱層析步驟，最終實現了ACE2 的高度純化。純化ACE2 的分子量約為98 kDa，得率為0.1%。

不同物種的ACE2 分子量在60～130 kDa 不等，其分子量的差異可歸因于不同程度的糖基化。糖基化是蛋白質翻譯后修飾的方式之一，在哺乳動物體內超過50%的蛋白質都會發生糖基化。本研究純化的豬ACE2 在SDS-PAGE（圖2D）及免疫印跡（圖2E）中顯示其分子量約為98 kDa，比重組豬ACE2（92 kDa）略高，提示天然ACE2 在合成及轉運過程中可能發生了糖基化、磷酸化等翻譯后修飾。PAS 染色結果證實了豬ACE2 是一種糖蛋白（圖6）。實際上，蛋白質糖基化具有識別定位、穩定蛋白質構象和信息傳遞等作用。

金屬離子作為蛋白酶結構的一部分或作為酶激活因子，對蛋白酶的穩定性有重要的影響。ACE2 是鋅離子蛋白酶家族成員，含有一段高保守的鋅結合序列，本研究結果也表明Zn能顯著激活其酶活性。質譜結果同樣顯示，ACE2 的第374～378位氨基酸殘基為HEMGH，該片段為ACE2 的鋅結合序列，與其功能和活性相關。另外，第402 位的谷氨酸高度保守，與第374 位的組氨酸同為ACE2的鋅離子配體，Zn與ACE2 的這些殘基位點形成配位鍵，對ACE2 的催化起重要作用。

蛋白質的結構和穩定性在決定其生理功能方面起著至關重要的作用，影響其結構的外在因素主要有pH、溫度、鹽濃度等。豬ACE2 與ACE 的熱變性溫度分別為67.5 與58.5 ℃。當溫度達到50 ℃時，ACE 的活性急劇下降，而ACE2 仍能保持90%的活性，表明ACE2 的熱穩定性更好。蛋白酶的穩定性通常與自身的結構相關聯，酶的活性位點是決定溫度對酶的重要影響因素之一。Towler等對重組人ACE2 胞外區域的晶體結構進行了解析，結果表明除了一些活性氨基酸被ACE2 的某些氨基酸替代外，ACE 的S2 活性口袋被ACE2 的Arg覆蓋，導致ACE2 的活性區域比ACE 狹小，這些區別使得兩者在水解底物及其他性質方面有差異。作為與高血壓密切相關的2 種酶，分析ACE2與ACE 在結構上的差異以及糖基化程度等，對于了解它們的酶學性質進而開發降血壓產品具有重要意義。

4 結論

對豬不同組織比較發現，豬腎中ACE2 含量最高，其分子量約為98 kDa，是一種典型的金屬蛋白酶。ACE2 的最適pH 為7.0，最適溫度為40 ℃，變性溫度為67.5 ℃。ACE2 含一個HEMGH 鋅離子結合域和第402 位的谷氨酸鋅離子結合配體。在鋅離子存在下，其活性增加62%。部分金屬離子如Cu、Fe和Cd對ACE2 的活性有抑制作用。ACE2 是糖基化蛋白，這也是其穩定性較好的一個因素。本研究為高效純化天然ACE2 提供了技術參考，為開發以ACE2 為靶標的功能性食品提供了思路。