酶解聯合高溫處理對可可粉風味的影響

錢 蕾，于海燕，婁新曼，田懷香,

（1.上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418；2.上海牡丹香精香料有限公司，上海 201210）

可可粉因其特有的風味（如巧克力、堅果香、花香、果香等），被廣泛應用于烘焙、冰淇淋等食品加工產業。近十年，全球可可消費的平均增長率為3%，而隨著消費升級發展中國家對可可的需求增長迅速。以中國為例，2010 年可可及可可制品進口貿易額為4.21 億美元，到2021 年進口額達10.45 億美元，年均增長率達8%以上，遠高于全球平均水平。全球60%可可豆產自西非，但其產量及品質受氣候變化、種植技術以及病蟲害的限制。面對原料供應限制以及需求增長，提高可可粉的質量并充分利用可可粉有助于相關食品工業和健康產品再加工。

在生可可豆中，內源酶的存在，如天冬氨酸蛋白酶協同羧肽酶作用，使可可豆水解形成具有可可特征香味的前體物—還原糖、氨基酸及短鏈肽。經過烘烤和干燥處理后，可促進氨基酸、肽與糖發生Maillard 反應，從而形成可可特征風味的香氣物質。其中，2,6-二甲基吡嗪（OAV 為0.2-1.3）、2-乙基-6-甲基吡嗪（OAV 為0.3～4.8）、2,5-二甲基-4-羥基呋喃酮（OAV 為74.3～186.5），呈現焦甜烘烤香氣，2-甲基丁醛（OAV 為3～14），醛類及內酯類化合物具有乳脂香氣，對整體巧克力風味有重要貢獻。目前，研究者已開展一系列利用生物化學技術優化可可風味的研究。Moulay 等利用蛋白酶和糖化酶處理可可粉，經過烘烤后可可粉中吡嗪類烘烤香化合物的濃度顯著上升。Voigt 等模擬重組可可豆內氨基酸混合物與糖進行美拉德反應，并進一步論證氨基酸和寡肽共同產生了可可的特征風味。然而，在自然環境中，內源性蛋白酶的酶解過程通常需要較長的時間（24～168 h），且得率相對較低。利用酶解、發酵等生物技術對天然動植物進行處理，其條件溫和、可控，且制備出的香料屬天然等同物，相較于其他香料制備方法更有優勢。

基于內源性酶在風味優化應用中的局限性，為了拓展和考察酶解聯合高溫工藝優化可可粉風味的可行性，本實驗擬采用5 種蛋白酶對脫脂可可粉酶解過程游離氨基酸的影響進行研究，并進一步采用頂空-氣相色譜-質譜聯用（headspace gas chromatography mass spectrometry，HS-GC-MS）結合香氣活度值（odor activity value，OAV）研究反應溫度對可可揮發性物質的影響?；贠AV 和感官評價，建立偏最小二乘（partial least squares，PLS）模型對聯合作用進行驗證，為進一步優化可可的風味品質研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫脂可可粉（L.）林氏香精公司；天冬氨酸型胃蛋白酶（1×10U/g）、菠蘿蛋白酶（100×10U/g）、木瓜蛋白酶（100×10U/g）龐博生物科技有限公司；酸性蛋白酶（50×10U/g）河南萬邦實業有限公司；風味蛋白酶（30×10U/g）東恒華道酶制劑公司；茚三酮、庚酸甲酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉·二水合、無水葡萄糖、果糖 上海國藥試劑公司。

SW23-40 型恒溫振蕩水浴槽 優萊博技術有限公司；Biofuge Stratos 臺式高速冷凍離心機 賽默飛科技公司；Cary60 型紫外-可見光分光光度計、7697A頂空-7890B-5977A 色譜質譜聯用儀 安捷倫科技有限公司；磁力加熱盤 艾卡儀器設備有限公司；pH 計 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 可可粉酶解試驗 為避免可可脂在含水的酶解過程水解生成其他小分子，選用脫脂可可粉以1:15（g:mL）加水或磷酸鹽緩沖液，磷酸緩沖液用于為蛋白酶酶解提供適宜的pH 條件，天冬氨酸酶和酸性蛋白酶需要加緩沖液，分別配制pH 為2.0 和3.5 的磷酸緩沖液，另3 個選擇加水，加水后可可粉與水混合物的pH 為6.4?；旌暇鶆?，分別加入天冬氨酸酶、酸性蛋白酶、風味酶、菠蘿蛋白酶、木瓜蛋白酶，溫度和pH 根據所添加酶的最適宜酶解條件進行設置，如表1 所示。將混配料液置于水浴振蕩鍋中酶解10 h，沸水浴10 min 滅酶。

表1 不同酶的酶解條件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different enzymes

1.2.2 總游離氨基酸測定 取可可粉酶解液（0.2 mL）、pH6 磷酸鹽緩沖溶液（0.5 mL）和茚三酮溶液（0.4 mL,2%乙醇溶液）于50 mL 比色管中，沸水浴加熱15 min，水浴冷卻，并加入去離子水定容至50 mL 充分混合。避光放置15 min 后，4500 r/min 離心8 min 取上清液。采用紫外-可見分光光度計在570 nm 波長處測定樣品吸光度。以丙氨酸為標準溶液，根據標準曲線y=0.7273x?0.2492（=0.995）計算得出酶解液中氨基酸濃度（mmol/L）。每個樣品重復測定3 次。

1.2.3 可可粉酶解液的高溫反應試驗 根據Maillard反應產香原理，將可可粉酶解液作為原料，與糖混合后加熱反應，形成具有特征香氣的Maillard 反應產物。35 mL 耐壓反應管中加入經過風味蛋白酶處理的可可粉酶解液15 g 和糖1.5 g（葡萄糖:果糖=3:7），油浴溫度范圍90～180 ℃，混合攪拌2 h。結束后水浴冷卻，4000 r/min 離心8 min，收集上清液，待風味物質鑒定及OAV 計算。

1.2.4 酶解聯合高溫處理反應物的制備 將5 種酶處理的可可粉酶解液按1.2.3 進行高溫反應，油浴溫度為150 ℃，待感官評價及風味物質鑒定。對照樣為未添加任何酶，加去離子水55 ℃水浴加熱3 h，后續高溫反應與酶解液一致。

1.2.5 感官評價 對1.2.4 可可聯合處理反應物進行感官評價。感官評價小組由6 位受過專業訓練的人員組成，通過評估標準樣品的香氣進行培訓?？煽筛泄倜枋鲈~參照歐洲可可協會出版的可可質量要求，如表2 所示。為了屏蔽固定序列相鄰樣品間的相互影響，評測時，將受試樣品根據拉丁方陣的順序進行編號。各項指標按照感受強烈程度1～10 打分，評價總分=嗅覺+0.2×味覺，總分100。

表2 感官描述詞和評分Table 2 Sensory evaluation descriptions

1.2.6 頂空-氣相色譜質譜聯用風味物質鑒定 頂空-氣相色譜質譜聯用風味物質分析方法參照朱宏等和Mohamadi Alasti 等的方法并做修改。

1.2.6.1 頂空條件 取可可粉酶解高溫處理反應物1.0 g 和20 μL 濃度為4.35 mg/mL 庚酸甲酯（內標）于20 mL 頂空瓶中，加蓋密封，放入進樣盤。樣品在90 ℃下平衡30 min，進樣過程中捕集器和傳輸線溫度分別為105 和110 ℃，進樣時間為1 min。

1.2.6.2 色譜條件 HP-5 色譜柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm；載氣He 氣流速度為1.2 mL/min。柱溫35 ℃起始，保持3 min，3 ℃/min 上升至160 ℃，再以10 ℃/min 上升至200 ℃，保持2 min；分流比10:1。

1.2.6.3 質譜條件 電離方式EI；電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；掃描質量范圍：35～500。

1.2.6.4 定性、定量分析 揮發性化合物的質譜與Wiley275、Nist11、Flavor 2 標準圖譜庫串聯檢索，保留質譜匹配度≥80；以相同色譜條件下正構烷烴（C～C）出峰保留時間，計算保留指數RI 值，并與NIST 數據庫的RI 值進行比對，兩種方法作為判定依據。揮發性化合物的定量采用內標（庚酸甲酯）半定量法，按式（1）計算出各成分相對含量（質量分數）。

式中：C表示該化合物的質量分數（μg/g）；A表示該成分的峰面積；C表示內標物的質量分數（μg/g）；A表示內標峰面積?？偣策M行3 次重復試驗，數據取3 次試驗平均值。

1.3 數據處理

采用Excel 2019、Origin 8 進行數據圖表的基本處理，IBM SPSS 20 進行檢驗及Waller-Duncan 方差分析（顯著性水平0.05），SIMCA 14.1 進行偏最小二乘分析，聚類樹圖通過R studio 制作。

2 結果與分析

2.1 不同蛋白酶對可可粉水解程度的影響

可可粉在經歷不同蛋白酶作用后，氨基酸濃度出現明顯差異（<0.05）。氨基酸被視作形成風味物質的重要前體物，為確保酶解充分，實驗時設計足夠長的酶解時間，定時取樣測定氨基酸濃度，將達到濃度峰值所用的時長作為酶解時間。由圖1 可知，5 種蛋白酶酶解時間不同，時間最短的是風味蛋白酶，水解時間3 h，時間最長的是菠蘿蛋白酶，為8 h。比較游離氨基酸總量，對可可粉酶解作用由大到小排序為：風味蛋白酶>菠蘿蛋白酶>天冬氨酸蛋白酶>木瓜蛋白酶>酸性蛋白酶。天冬氨酸酶和酸性蛋白酶屬酸性蛋白酶，水解溫度為40 ℃，得到氨基酸含量分別為0.09 和0.06 mmol/g；風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶屬中性蛋白酶，水解溫度為55 ℃，得到氨基酸含量分別為0.20、0.14 和0.08 mmol/g。酶解作用差異的原因可能與酶的特異性有關，如菠蘿蛋白酶和天冬氨酸酶選擇性水解7S 大豆球蛋白，木瓜蛋白酶選擇性水解11S 大豆球蛋白，而可可豆中7S 球蛋白含量高于11S，因此菠蘿蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶作用后氨基酸濃度更高。Rohstus 等測定生可可豆的氨基酸含量為5～25 mg/g；Kadow 等在35 ℃觀察可可發酵5 d，每克可可降解出的游離氨基酸含量范圍5.7～25.2 mg，氨基酸摩爾質量為70～180 g/mol，換算后范圍在0.03～0.36 mmol/g，本文酶解液中游離氨基酸含量為0.06～0.20 mmol/g，與文獻范圍符合。

圖1 5 種蛋白酶酶解可可粉后氨基酸含量變化關系Fig.1 Changes in the concentration of free amino acid from five enzymic hydrolysates

2.2 高溫處理對可可風味物質的影響

Maillard 反應物的香氣屬性取決于溫度和反應時間，除了巧克力制作，可可粉還可用作飲料沖劑以及烘焙產品的添加，這些實際應用場景的溫度在100～200 ℃。

本文選擇2.1 中酶解作用最顯著的風味蛋白酶，考察其可可粉酶解液在90～180 ℃溫度中揮發性物質的變化，試驗證明高溫加熱有利于揮發物種類和含量的提升，一共檢測出44 種風味物質，不同溫度條件下分別鑒定出18（90 ℃）、15（100 ℃）、22（120 ℃）、32（135 ℃）、38（150 ℃）和34（180 ℃）種。特征型揮發物的變化如下：90 和100 ℃產物的差異較小，奶油香的2,3-丁二酮（從0.35 μg/g 增加至1.13 μg/g）在整個溫度范圍始終存在，與文獻[30]中醛酮類物質烘烤前后濃度由0.13 μg/g 提升至7.82 μg/g 變化一致。具有果香的2-甲基丁醇（從0.03 μg/g 增加至0.19 μg/g）和巧克力香的2-甲基丁醛（2.03 μg/g 增加至16.65 μg/g）在120 ℃產物中開始累積，135 ℃產物中開始出現甲酸（從0.50 μg/g 增加至5.44 μg/g）、乙酸（從0.23 μg/g 增加至23.83 μg/g），小分子酸為Maillard 反應產物；150 和180 ℃產生了巧克力香的甲基吡嗪（從0.03 μg/g 增加至0.10 μg/g）、糠醇（0.11 μg/g 增加至0.43 μg/g）以及焦甜香的糠醛（從0.07 μg/g 增加至24.10 μg/g）等雜環類物質，天然存在于可可、咖啡、肉類中，被視作可可香精的重要成分，整體焦甜香更濃郁。高溫條件對揮發物的影響，推測是酶解后的氨基酸在烘烤過程與糖發生Maillard 反應，生成更豐富的揮發物。如圖2C～2E中，2,3-丁二醇、糠醇、2-甲基丁醇在135 ℃以上出現濃度減少的趨勢（如圖2F），醇類擁有甜蜜和花香，它既是醛的前體，又可參與酯化反應，伴隨著烘烤溫度提升，一部分轉化成醛類或者酯類，進一步增加樣本的焦甜香味物質。

圖2 不同反應溫度的可可粉酶解液揮發物變化圖Fig.2 Changes of cocoa enzymic hydrolysates volatile compounds at different temperature

不同溫度處理物中鑒定出的44 種化合物，結合質量分數及其對應閾值，計算OAV（OAV，各成分的濃度與閾值之比）。其中，OAV>1.0 的化合物一共有20 種，經標準化處理后以聚類樹圖的方式討論溫度對樣品風味的影響。

如圖3 所示，共有三類變化趨勢：第一類在90～150 ℃物質含量沒有顯著變化（>0.05），180 ℃產物中含量顯著提高（<0.05），包括乙酸、己酸甲酯、糠醛、5-甲基糠醛等，表現出酸、果香和焦甜，糠醛和5-甲基糠醛為焦糖化和美拉德反應中的特征物質；第二類隨著溫度升高，含量逐步增加，且150～180 ℃增量趨勢放緩，包括丁二酮、2-甲基丁醛、2-甲基丁醇和吡嗪，天然存在于烘烤后可可豆中，表現出巧克力和奶油香氣；第三類隨著溫度升高，含量先增多后減少且在150 ℃含量最高，包括苯乙醛、壬醛和2,3-二甲基-5-乙基吡嗪，表現出花果香和巧克力特征香。巧克力特征香的物質集中于第二、三類，150 和180 ℃產物的巧克力特征香更豐富，與文獻[10]可可豆烘烤溫度大于140 ℃各揮發物濃度提高的現象一致。當溫度達180 ℃時，吡嗪的OAV 減弱而具有洋蔥味的二甲基二硫醚的OAV 顯現，各揮發物對香氣貢獻從OAV 判斷不及150 ℃樣品。通過高溫處理可可粉酶解液，溫度達150 ℃能較好地發揮樣品風味及其整體香氣效果，使整體巧克力風味最佳。

圖3 不同反應溫度對可可揮發物OAV 的聚類樹圖Fig.3 Tree graph of different temperature on the volatile OAV of cocoa

2.3 酶解聯合高溫反應物的揮發性物質分析

利用HS-GC-MS 方法對5 種可可粉酶解液經150 ℃高溫處理2 h 后揮發性化合物進行研究。表3總結了HS-GC-MS 分析結果。通過質譜庫比對及保留指數，共鑒定出48 種揮發性成分，其中雜環14 種、酮10 種、酸9 種、醇6 種、醛5 種、酯4 種，其中有26 種出現于相關可可粉風味分析的文獻中。與未經酶解的高溫處理樣品（12 種）相比，酶解處理后（29 種以上）揮發性化合物更加豐富，而不同酶解樣品的揮發物種類保持一定共性，共有化合物為15 種，占總數的1/3。其中，雜環物質的數量最多，為呋喃類和吡嗪類。不同酶處理的可可粉酶解液經高溫處理后各類香氣種類和質量分數上存在顯著差異（<0.05），可能原因是水解氨基酸組成及其加熱時Maillard 反應形成揮發物差異引起的。呋喃主要由糖自降解和焦糖化過程中生成，2-乙?；秽哂袌怨咎鹣?，5 個反應樣中均檢測到，風味酶處理樣中含量最高（133.79±6.55）μg/g。吡嗪類物質由-二羰基化合物與氨基酸發生Strecker 降解生成，閾值低，香氣作用強。對于2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪和四甲基吡嗪3 種吡嗪化合物的總量，天冬氨酸酶處理樣中最高（2.53±1.51）μg/g，賦予產品巧克力風味?？反己涂啡?、苯乙醇和苯乙醛兩組化合物成對存在，醇類貢獻花果香氣，它既是醛的前體，又參與酯化反應，因此隨著反應進程推進，醇含量逐步減少，而醛含量不斷累積。具有強烈花香的苯乙醛，風味酶處理樣中最高含量（31.70±22.42）μg/g，是對照樣品中含量（2.87±0.03）μg/g 的10 倍，原因是其在反應過程中大量的苯乙醇轉化為苯乙醛，這也解釋了苯乙醇在對照樣中含量最高（14.42±0.98）μg/g。酸性酶處理樣中酸類物質含量豐富，主要是小分子乙酸，但乙酸的閾值較高且易揮發，對整體香氣作用較弱。此外，庚酸的存在為樣品增加乳脂的香味。菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶處理樣產物種類最豐富，具有菠蘿香的庚酸乙酯為菠蘿蛋白酶解物獨有的，但揮發物總量不具優勢，從水解出氨基酸總量的劣勢側面解釋了菠蘿蛋白酶和木瓜蛋白酶單一作用時的不足，若進一步與多種酶協同作用，既能彌補水解程度不足的缺點，還能發揮產物豐富的優勢。

表3 可可聯合處理反應物的揮發物HS-GC-MS 分析Table 3 Contents of volatile compounds from cocoa combined reactants by HS-GC-MS

2.4 可可聯合處理反應物的感官評價

可可粉經酶解和150 ℃高溫處理2 h 后，其感官評價如圖4 所示。與未經酶處理的對照樣相比，巧克力、奶香、焦糖、辛香、煙熏5 項指標有極顯著差異（<0.01），花香、堅果和木香感官指標有顯著差異（<0.05）。其中，風味蛋白酶組在巧克力、奶香、堅果香氣方面表現最佳，酸性蛋白酶的酸味、辛香最顯著，菠蘿蛋白酶的焦糖和甜味表現更好。綜合比較反應物的總體風味，風味蛋白酶組的總分最高。

圖4 可可聯合處理反應物的感官評價Fig.4 Sensory evaluation on enzymatic hydrolysis combined with high temperature of cocoa

2.5 PLS 分析可可聯合處理反應物與感官屬性的關系

為了探究不同反應物的感官屬性和揮發性風味物質的差異，以其揮發物的OAV 為自變量，通過對5 種聯合處理可可粉的感官評價，各感官屬性得分作為因變量進行偏最小二乘分析。利用Simca 軟件的PLS 模塊對風味成分和感官屬性進行相關性分析，前三個主成分共計解釋了88.8%的差異，分析結果具有代表性。經不同聯合處理的可可粉，感官屬性預測分析如圖5 所示。

圖5 不同酶處理樣品與感官屬性的PLS 圖Fig.5 Partial least squares regression of cocoa samples and sensory indicators

比較分析感官屬性分布，聯合處理樣品與未經酶處理的對照樣有顯著差異（<0.05），苦、酸等負面感受的感官屬性處于第三象限，可可特征香屬性分布于第四象限。5 種酶解樣品中木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶距離對照樣最近，在酶解過程釋放游離氨基酸較少，導致其風味與對照樣較接近，整體香氣除具備一定可可粉特征香氣外，還帶有一定的果酸味。天冬氨酸酶與酸性蛋白酶的風味接近，具備一定煙熏辛香，還帶有明顯的油脂味；風味蛋白酶樣品與對照樣香氣感官差異最明顯，與巧克力特征香有更強的相關性，堅果香、奶香作用顯著，同時果甜香更豐富，果香也是突出于普通可可粉的風味優勢，這也與感官評價的結果相一致。

3 結論

本文深入探究了酶解聯合高溫處理對可可粉風味特性的影響。蛋白酶解作用提升了游離氨基酸的濃度，因蛋白酶的特異性對脫脂可可粉的酶解效果造成差異，風味蛋白酶、菠蘿蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶處理后游離氨基酸濃度分別提升至0.20、0.14、0.09、0.08 和0.06 mmol/g。150 ℃以上的高溫處理使游離氨基酸與還原糖發生Maillard 反應，促進風味物質的生成，表現出花果香和巧克力特征香。由偏最小二乘模型模型驗證，酶解聯合高溫處理有助于提高樣品的奶香味和花果香，經風味蛋白酶處理3 h 的可可粉在150 ℃加熱2 h，既保有其本身的巧克力、焦甜和奶油香氣，同時額外的花果香使香氣更加豐富。由此可得，酶解工藝有助于提高可可粉中游離氨基酸的含量，高溫促使可可特征風味的形成，酶解聯合高溫處理對可可風味的優化及香精制備工藝提供了理論以及和技術支持。