有機廢料合成聚羥基脂肪酸酯的研究進展

劉澤清，宋秀蘭

(太原理工大學 環境科學與工程學院，山西 太原 030600)

聚羥基脂肪酸酯(PHA)作為一種生態塑料，具有與傳統石油基塑料相似的物化特征，同時易被微生物降解[1]，可作為傳統塑料的替代品。PHA具有優越的熱加工性、生物降解性和生物相容性，廣泛應用于生物醫學設備、電子、建筑、汽車、包裝和農業等領域[2]。

PHA是一種微生物聚酯，在許多原核生物中以胞內顆粒的形式積累[3]，主要用作貯藏材料應對外部碳源不足。這些微生物在碳源充足但營養條件受到限制的條件下(如氮限制、磷限制、溶解氧限制等)合成PHA。2021年3月，我國明確把碳中和納入生態文明建設整體布局，而PHA的生產有利于實現碳中和的目標。為了降低成本，企業通常選擇廢棄物(如油脂、甘油、木質纖維素、糖蜜等)直接或發酵作為碳源，這一過程既可以實現廢物利用，又可以減少甲烷的排放。然后，利用篩選出的產PHA細菌攝取碳源合成PHA；最后提純富集出PHA。而PHA生產成本至少是傳統塑料如聚丙烯(PP)、聚乙烯(PE)或聚乳酸(PLA)的3倍[4]，故推動PHA的深入研究刻不容緩，這對構建環境友好型社會有重要意義。

1 聚羥基脂肪酸酯(PHA)的特征

PHA主要由單體羥基脂肪酸(HA)聚合而成[5]，根據其單體中碳原子的數目，可分為短鏈PHA(Scl-PHA)、中鏈PHA(Mcl-PHA)和長鏈PHA(Lcl-PHA)。短鏈PHA的單體有3～5個碳原子，包括3-羥基丁酸鹽(3HB)和3-羥基戊酸鹽(3HV)等；中鏈PHA的單體有6～14個碳原子，包括3-羥基辛酸鹽(3HO)、3-羥基壬酸鹽(3HN)和3-羥基己酸鹽(3HHx)等；長鏈PHA的單體則具有15個以上的碳原子。短鏈PHA具有較好的晶體力學性能，但脆性大。中鏈PHA在零下也不會變脆，可作為優異的彈性材料和生物橡膠，但其熔化溫度大多接近室溫[6]。根據PHA的單體是否均一，可將PHA分為均聚物和共聚物[7]。對于當前已知的PHA聚合物，只有PHB和PHV屬于均聚物，其他均屬于共聚物，如3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯共聚物(PHBV)。研究表明，與均聚物相比，共聚物表現出更優異的性能[8]，故當前共聚物的研究受到越來越多的關注。

生物體內積累的PHA顆粒，稱為碳小體[9]，一般呈現出高度折疊的顆粒形狀，由PHA(97.7%)、蛋白質(1.8%)和磷脂(0.5%)組成[10]。PHA顆粒由兩層物質組成，內層是疏水性的聚酯核，外層是親水親脂的兩親層，兩親層為內層疏水性聚酯核在水性細胞質環境中提供增溶作用[11]。PHA顆粒的結構見圖1。

圖1 PHA顆粒的結構[11]Fig.1 Structure of PHA particles

2 有機廢料合成PHA

總體來說，有三種方式可以合成PHA：酶催化、轉基因植物合成和微生物發酵[12]。工業生產PHA主要是應用天然或者基因重組菌株進行生產，其優點是產品純度高，提純便利，但需要創建一個單一菌種環境，而這一過程造價昂貴且難以控制[1]。由此，混菌生產PHA工藝進入了研究者的視野。微生物生產PHA成本的50%來源于菌種的碳源[13]，碳源還影響細胞生長、細胞代謝的潛能以及聚合物的產量、產率、分子量、品質和組成[14]。碳源的選擇被視為PHA商業規模生產的主要影響參數和瓶頸。

2.1 剩余污泥發酵液作為碳源

污水處理廠每天都會產生大量剩余活性污泥——作為污水凈化的副產物，而剩余污泥中含有碳水化合物、蛋白質等有機物。如果能將剩余污泥資源化利用，不光可以降低污水廠處理成本，還能促進廢物回收。剩余污泥發酵會產生大量揮發性脂肪酸(VFA)，這些VFA可以用作合成PHA的碳源。通常，剩余污泥應用于混菌三段式PHA生產工藝，見圖2。除了VFA外，污泥發酵液中還有一部分非VFA物質——溶解性有機物(DOM，包括碳水化合物和蛋白質)和營養元素(包括氮和磷)。細菌對DOM攝取速度低于VFA，同時，過量的DOM會抑制產PHA細菌的富集和PHA的合成，但DOM也可以作為碳源合成PHA，且能夠促進污泥的穩定[15]，因此發酵液中DOM需要達到一個平衡濃度。污泥發酵液中過量的氮、磷則會破壞PHA的生產條件，有研究發現[16]，當磷濃度從 127.60 mg/L 限制到 1.35 mg/L 時，胞內PHA質量含量從23%增加到51%，表明較低的磷濃度將促進PHA積累。高磷濃度有利于蛋白質合成，而降低磷濃度會導致蛋白質合成減少，從而增加PHA的產量。污泥與生活廢物共發酵液比單獨污泥發酵液產生更多的VFA，能夠有效降低DOM比例，Valentino等[17]在中試規模上將城市固體廢物與污泥共發酵(市政廢物體積占比30%～35%，污泥體積占比70%～75%，42 ℃)，得到的發酵液VFA占SCOD為(75±9)%，SCOD/N/P為100/4.4/0.5。在分批試驗中，混菌能夠積累高達46%(質量分數)的PHA。污泥堿性發酵同樣可以改善發酵液性能，Liu等[18]在pH 10條件下發酵污泥，得到的發酵液VFA占比達到(61.8±3.1)%，在添加少量氮磷情況下進行PHA積累試驗，PHA含量達細胞干重60.3%，回收的多聚物中單體比例(按質量計)為98.3% HB和1.7% HV。此外，發酵液中VFA成分(乙酸、丙酸、丁酸、戊酸)比例也會影響PHA的產率和單體組成，進而影響PHA的性能。一般認為，偶數碳VFA用來生產HB單體，而奇數碳VFA用來生產HV單體[19]。而HV單體的加入可以改善PHA性能，如降低熔點和提高延展性。HAO等[20]發現戊酸占VFA比例52.05%的發酵液可以用來生產HV和3-羥基-2-甲基戊酸鹽(3H2MV)單體占比更高的PHA多聚物，且產PHA細菌富集反應器中，PHA最大含量為42.31%，HB、HV、3H2MV占比達到68.4，23.7，7.9 mmol C%。現在的研究大多在發酵液使用前除氮、磷，并在PHA合成達到最高時(碳充盈階段結束)排放掉上清液以排除溶解性有機物的影響，但這不可避免地增加了工藝的成本與復雜性。未來的研究可著眼于調整發酵策略，如調整pH或投加藥劑，降低發酵液中非VFA物質比例，改變VFA成分占比，并且有必要確定發酵液中非VFA物質水解機制。

圖2 混菌三段式合成PHA工藝Fig.2 Mixed bacteria three-stage synthesis of PHA process

2.2 廢棄油脂作為碳源

油脂相比其他傳統碳源(如葡萄糖等)具有價格低廉和PHA產量高的優勢[12]。中國社會每年產生廢油脂超過1 000萬t。當下，純菌利用廢棄植物油或廢棄動物脂肪作為碳源合成PHA的研究較多。油在煎炸的過程中會經歷許多化學反應，例如在較高溫度下水解、熱氧化和聚合，因此不需要任何預處理就可以用于PHA生產[21]。有研究表明[13]，將 0.1%(v/v)吐溫80(Tween-80)表面活性劑添加到1%(v/v)廢棄食用油(植物油)可提高菌株細胞干重，副球菌(Paracoccus) LL1菌株可在96 h內生產1.0 mg/L的PHBV共聚物，同時合成0.89 mg/L的類胡蘿卜素副產品，緩解了PHA生產成本壓力。但是，很多產PHA細菌無法直接攝取動物脂肪。對于這個問題，Romanelli等[22]將斯圖茲里假單胞菌(Pseudomonasstutzeri) BT3菌株的lipC和lipH基因共表達到嗜酸菌(Delftiaacidovorans) DSM39菌株上，重組菌株可直接攝取動物屠宰場豬油脂合成PHA。合成的多聚物細胞干重占比達到43%。Riedel等[23]則在野生型Ralstoniaeutropha菌株基礎上進行基因改造。原菌株在脂肪底物中產生每細胞干重79%～82%(w/w)的PHB，而重組細菌可以合成聚(羥基丁酸酯-羥基己酸酯)[P(HB-co-HHx)]，其產量達到每細胞干重的45%～72%，HHx含量達到16%～27%。這種共聚物比均聚物PHB性能優異，更適合于商業生產。

混菌利用廢棄油脂可以應用三階段工藝合成PHA。油脂用作碳源的優勢在于不需要第一階段的發酵單元，油脂可在第二階段(產PHA菌富集)和第三階段(PHA合成)水解。Ghosh等[24]研究表明，來自煉油廠的活性污泥有利用含油廢水合成PHA的能力。實驗發現，在碳充盈階段微生物積累40%～70%的PHA，而在碳匱乏階段PHA用于微生物的代謝，最終PHA的合成率在0.38～0.89 mg PHA/mg COD 之間。也有研究發現，與純菌合成PHA類似，混菌不光可以利用油脂生產PHA，還可以同時生產增值產品，如三酰甘油(TAG)。Argiz等[25]利用罐頭工業生產的殘余油為碳源生產PHA和TAG。試驗在序批式反應器(SBR)中進行產PHA菌的富集，在分批補料反應器(FBR)進行聚合物的合成。在分批補料應器中，將碳源和氮源分批供給，即只在碳匱乏階段供給氮源，使PHA最大產量達到細胞干重82.3%。該研究證明了混菌也可以具有利用油脂合成PHA并同時生產另外一種增值產品的潛力。但油脂作為混菌碳源的弱勢在于微生物攝取速率低，由此產PHA菌的富集時間被延長，Ghosh等[24]的好氧顆粒反應器(AGR)在42 d才開始穩定，而Argiz等[25]的SBR反應器在50 d才達到穩定狀態，不利于工業化應用。油脂，尤其是具有飽和碳鏈的長鏈脂肪酸，作為碳源時的微生物攝取率不如其他底物，而且PHA產率較低。在今后的研究中可以向油脂中添加活性劑或者通過厭氧消化、酯交換法等預處理技術提高油脂的微生物利用率，進而提高PHA的產率。

2.3 柴油煉制廢物(甘油)作為碳源

在全球范圍內，大量粗甘油作為柴油產業的副產品被生產出來，粗甘油中含有62%～90%的甘油[26]。由于碳結構較少，甘油被認為是PHA合成的有效碳源。而且，甘油作為碳源合成PHA也可以彌補柴油生產過程的成本問題。有研究表明[27]，副球菌LL1菌株在添加2%甘油的礦物培養基中，96 h合成了3.77 g/L PHA，同時產生3.6 mg/L類胡蘿卜素。而且，通過副球菌LL1的細胞保留培養，總細胞干重增加了2.2倍，最大細胞干重(24.2 g/L)下PHA含量達到39.3%(w/w)，并提高了總類胡蘿卜素的產量。然而，在粗甘油中有許多其他的化學成分，包括生物柴油殘渣、皂類、甲醇等[12]，這給直接生物合成PHA造成困難。而貪銅菌(Cupriavidusnecator)DSM545菌株可直接利用生物柴油中的粗甘油生產短鏈PHA的共聚物聚(3-羥基丁酸酯-4-羥基丁酸酯)[P(3HB-co-4HB)]。通過控制溶解氧和培養時間，可獲得4HB摩爾分數在11.4%～21.5%之間的共聚物[28]。Gosh等[24]則利用從煉油廠分離出來微球菌(Micrococcusaloeverae)SG002菌株，用以柴油為基礎的含油廢水，在好氧顆粒反應器(AGR)中進行PHA的合成。經過21 d的培養，菌株達到 (81.40±0.2)% 的碳氫化合物去除率，PHA積累最大達到(0.47±0.01)mg PHA/mg CDW。對于粗甘油的利用，其最大阻力在于甲醇，它是細菌活動的抑制劑，可通過蒸發或相分離方法去除，但會增加成本；此外可考慮粗甘油與其他碳源共基質，以提高PHA產率。

2.4 木質纖維素及其衍生物作為碳源

木質纖維素是植物細胞壁的主要成分，許多種類的假單胞菌(Pseudomonas)都能攝取木質素[7]。假單胞菌可以分泌木質素降解酶(如漆酶和過氧化物酶)用于木質素解聚[29]。Unrean等[30]以堿性預處理甘蔗渣發酵液為碳源，對蒙氏假單胞菌(Pseudomonasmonteilii)生產PHA的工藝進行了優化。在最優投料條件下(碳氮比為0.18 g木質素∶1 mg NH4Cl)，實驗獲得238 mg/L的PHA聚合物，相當于細胞干重(DCW)13%。Wang等[31]在基因水平上對惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida) A514菌株進行改造。該菌株以木質素衍生物香草醛酸為碳源，PHA產量達到246 mg/L，為細胞干重34.5%(w/w)。同時，木質素衍生物還可以與其他碳源聯用作為細菌底物，以達到優化PHA結構及產量的效果。Xu等[32]將木質素衍生物(苯甲酸鹽、香草醛和香草醛酸)和甘油共進料，作為惡臭假單胞菌KT2440菌株的碳源。與單獨投喂甘油相比，共基質下菌株細胞干重最大增加16.1%，PHA含量最大增加63.2%。而且，在甘油中添加木質素衍生物可使長鏈單體(C10和C12)的分布減少0.4%～4.4%，短鏈單體(C6和C8)的分布增加0.8%～3.5%。木質纖維素材料的緊密結構阻礙了碳水化合物的酶水解，因此，直接利用木質素前需要經過一系列預處理。木質纖維素常見的預處理方法包括蒸汽爆破處理、熱處理、酸處理、堿處理、有機溶劑處理等[33]。Sawant等[34]利用里氏木霉和黑曲霉共培養制備的纖維素酶將玉米秸稈水解為粗糖。然后副球菌LL1菌株利用40 g/L的玉米秸稈發解液為碳源，PHA產量達到9.71 g/L。當前關于木質纖維素合成PHA的大部分研究都是利用其發酵液為碳源，而在此基礎上開發能夠降解木質素并產生PHA的微生物菌株，將是有效提高木質素轉化率的可行性選擇。

2.5 制糖業廢料(糖蜜)作為碳源

糖蜜是制糖產業的主要副產物，是一種粘稠、黑褐色、呈半流動狀態的物質。糖蜜作為生產PHA的碳源也得到了廣泛的研究。Akaraonye等[35]用甘蔗糖蜜作為蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus) SPV菌株的碳源生產PHB。在1 L搖瓶試驗中獲得的PHB達到細胞干重61.07%，在2 L發酵罐研究中獲得的PHB 達到細胞干重的51.37%。而Cui等[36]通過使用合成糖蜜廢水培養地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)，研究報告了溫度對細菌合成PHA過程的影響。確定高溫有利于提高地中海富鹽菌的PHA產量。最近，研究者將糖蜜和其他碳源聯用，達到合成PHA共聚物的效果。從棗樹中獲得的可再生資源——棗子籽油和棗子糖蜜可以用作貪銅菌的碳源，以生產P(3HB-co-3HHx) 共聚物。同時，通過改變供給細菌共基質的數量比例可以選擇性地調節共聚物中3HHx和3HB單體的摩爾分數[37]。盡管糖蜜作為純菌碳源時產量較高，但從黏稠底物中提取PHA仍然存在困難，針對不同的產PHA菌種，提出不同的提取方案仍是比較關鍵的。

糖蜜同樣被應用于混菌合成PHA，研究內容集中在微生物群落的結構和生產力。有研究表明[38]，以糖蜜發酵液作為碳源，在PHA的合成階段控制pH為8比不控制pH的生物量提高1倍，從而使PHA產率提高了1倍。Carvalho等[39]以糖蜜發酵液為底物，探究了微生物組成與PHA生產性能的關系。研究發現，攝取發酵糖蜜的產PHA菌群主要由固氮弓菌(Azoarcus)、陶厄氏菌(Thauera)和副球菌組成，前兩種菌群的豐度最高。以固氮弓菌富集為主要組分，陶厄氏菌為次要組分的混合微生物可產生高HV含量的聚合物，這可能會改善PHA的機械性能。糖蜜發酵液濃度對混合菌群合成PHA也存在影響，研究表明[40]，在進水糖蜜發酵液濃度為 45 Cmmol VFA/L時，微生物顯示出最佳PHA儲存能力。在這種培養條件下產PHA菌生長旺盛，PHA含量最高可達細胞干重74.6%。為了更加有效地利用糖蜜，需要消除糖蜜中抑制微生物生長的污染物，如酚類和無機鹽。糖蜜在發酵前使用各種膜濾技術有可能去除部分污染物，而這有待于更加深入的研究。

表1 各種有機廢料作為碳源生產PHA實例Table 1 Examples of PHA production from organic wastes as a carbon source

3 PHA的提取工藝

在PHA積累階段完成后，一般通過離心、過濾或沉淀將生物量從基質中分離出來，下一階段需要從生物量中提取PHA。生物量中影響PHA純度的雜質統稱為非PHA細胞物，包括多肽、磷脂、DNA、RNA和肽聚糖等[1]。混菌比純菌培養的細胞更耐水解，故從混菌細胞中提取PHA通常需要預處理，而在純菌培養條件下無需任何預處理可以直接提取[41]。

PHA的提取有兩種方式：第一種方式依賴溶劑打破細胞膜并溶解PHA顆粒，這一般是通過加入二氯甲烷或氯仿等物質實現[42]；第二種方式旨在消化和溶解細胞內的非PHA物質，使PHA成為不溶性固體。這種消化過程可以是生物的(例如酶)或化學的[43]。第二種方式的優點在于減少試劑投入量從而降低試劑成本。近些年，還有研究者用動物提取PHA，這種提取方式獲取的PHA更接近自然形態。

3.1 從生物質中直接提取PHA

使用溶劑直接從生物質中萃取PHA在提取工藝中應用最為廣泛，可回收高純度PHA[44]。溶劑的作用是改變細胞膜的通透性，并使PHA溶解[1]。在大多數情況下，無論選取哪種萃取劑，在從富含PHA的生物質中提取PHA之前都需要對生物質進行冷凍干燥處理，因為生物質中水分的殘留會降低提取效率。相比加熱干燥，凍干不會導致聚酯鏈的斷裂[45]，但冷凍干燥設備工藝復雜，在工業應用中會花費巨大的成本。

大量鹵化溶劑，如氯仿和二氯甲烷，被廣泛用于PHA的萃取過程。通過鹵化溶劑萃取，可以高效地獲得高純度的多聚物，并且可忽略少量多聚物的降解。然而，這種萃取方式并不環保，尤其是氯化溶劑，對環境和工作人員會造成危害。此外，該過程需要大量的溶劑，溶劑加入量高達生物量的20倍[46]。針對鹵化試劑的缺點，研究者將目光轉向非鹵化溶劑。研究表明[19]，碳酸二甲酯(DMC)可用作PHA提取的溶劑，1-丁醇用于PHA的沉淀純化。試驗發現每100 g生物量的PHA提取量為(30.7±1.6)g，PHA總純度達到(98.0±0.1)%。通常，非鹵化溶劑能夠很好地溶解中等鏈長PHA。Bartels等[44]用丙酮對生物質中的P(HB-co-HHx)進行兩階段的萃取，并用2-丙醇進行純化沉淀，最終從細胞中提取高達98%～99%的多聚物。非鹵化溶劑的使用有助于降低PHA的生產成本，并形成一個更加生態化的過程，這都有助于PHA的商業化進程。

3.2 破壞細胞內非PHA物質間接提取PHA

PHA通常被細胞中非PHA物質包被，次氯酸鈉、表面活性劑、酸堿化合物可用于溶解這些非PHA物質。另外，這些試劑均可以在水中使用，與溶劑萃取相比，不需要干燥生物質，可極大地降低成本[1]。Colombo等[47]使用非離子表面活性劑吐溫-20(Tween-20)對生物質進行預處理，然后使用碳酸二甲酯提取PHA，PHA提取效率可達50%，與使用氯仿獲得的提取效率(63%)非常接近。此外，將兩種預處理試劑聯用也可以達到不錯的效果。Mannina等[41]先用次氯酸鈉處理生物質，然后用月桂酸銨消化細胞內非PHA物質(月桂酸銨與生物量質量比為2∶1)，接觸反應3 h，獲得PHA回收率和純度分別為(74±8)%和(100±5)%。一般來說，化學消化最大的缺點在于PHA降解，且化學消化過程會產生大量廢水。因此，有研究[42]提出用稀氨水消化細胞內非PHA物質，結果證明稀氨水在75～115 ℃ 的溫度下對生物質進行處理，可獲得近90%的PHA回收率和90%以上的純度。該研究為提取工藝優化提供了一個有價值的方向。

蛋白酶、磷脂酶、溶菌酶和核酸酶等酶可水解細胞內非PHA細胞物[1]，且由于酶對催化反應的高度特異性，不會導致PHA大量降解。Lakshman等[48]使用來自小雙孢菌屬(Microbispor)的裂解酶對含有50% PHA的草木犀中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)進行酶消化，實現了94%的PHA回收率和92%的PHA純度。雖然酶消化是一種環境友好的方法，但是因為其工藝的復雜性，在工業還難以應用。

此外，有研究者發現可利用生物體回收PHA。有些動物的消化系統能夠攝取細菌細胞，但不能同化PHA顆粒，最后將其以糞便的形式排出，從而導致PHA回收和純化。通過這種生物回收方法回收的PHA接近其在細胞中的固有形態，即以顆粒形式存在。Murugan等[49]發現粉虱可以吃掉冷凍干燥的貪銅菌細胞，然后以白色糞便的形式排出PHA顆粒。經過洗滌、加熱進一步純化后，PHA顆粒純度幾乎達到100%。可能其他昆蟲在PHA顆粒回收方面更加有效，而這需要進一步的探索，使用生物的方法回收PHA可以最大限度減少化學試劑的使用。

表2 各種方法提取PHA實例Table 2 Examples of PHA extraction methods

4 結束語

PHA以優異的生物降解性能，有望成為傳統石油基塑料的替代品，卻因為高額的成本無法得到大規模的推廣。近些年，大部分研究對PHA生產的碳源選擇和提取方式進行了優化，試圖找到生產成本最低且產品性能最優的工藝。

(1) 開發用于PHA生產的有機廢料具有雙重好處，該過程不但能解決環境中廢物處理問題，且更具可持續性和成本效益。不過，微生物對廢料的利用率仍然較低，而這可以在往后的研究中通過對原料適當預處理、優化操作參數以及利用基因工程來克服。

(2) 不同的PHA提純方式在成本要求、分離產率、產品純度方面以及生物對PHA產品的適用性方面存在很大差異。在這種情況下，必須確定該提純是否符合所設想的生物聚合物最終應用的要求。

(3) 當前的研究大多還停留在實驗室階段，缺少中試規模，更缺乏產業應用前的可行性研究。目前商業方面的PHA生產多為純菌生產，而成本相對較低的混菌生產方式有待進一步推廣。未來可著眼于混菌生產PHA的研究，并應用環保且成本較低的PHA提純方式，致力于碳中和的社會目標。