好氧堆肥對抗生素抗性基因的消長影響研究進展

鐘為章，陳賽男，李月，潘子欣，洪晨，秦學，李再興

(1.河北科技大學 環境科學與工程學院，河北省污染防治生物技術實驗室，河北 石家莊 050018； 2.北京科技大學 能源與環境工程學院，北京市工業典型污染物資源化處理重點實驗室，北京 100083)

我國是抗生素生產大國，每年因生產抗生素而產生的菌渣量達到13萬t以上[1]。抗生素被大量濫用于畜牧養殖業，殘留的抗生素會產生大量抗生素抗性基因(ARGs)，這些ARGs在環境中的日益出現和傳播對臨床感染治療和人類健康構成了重大威脅。這些ARGs可能通過傳播到生長在施肥土壤中的植物而遷移到食物鏈中或者可以通過由移動遺傳元件(如整合子、轉座子或質粒)介導的水平基因轉移(HGT)傳播到更廣泛的土壤細菌群落中。施用糞肥或者抗生素菌渣填埋會促進細菌宿主生長，從而導致土壤中殘留ARGs含量的增加。由于大量的抗生素菌渣填埋導致在農業生態系統中出現的ARGs引起了全球關注，人們逐漸意識到ARGs在環境中的持久性殘留、傳播和擴散的危害比抗生素本身還要大，因此迫切需要開發有效的工藝措施來減輕ARGs在環境中的傳播已成為當今急需解決的難題。目前處理抗生素抗性菌(ARB)和ARGs的方法及優缺點分析見表1。

表1 ARB和ARGs處理技術優缺點對比Table 1 Comparison of advantages and disadvantages of ARB and ARGs processing technology

這些工藝不僅能高效去除ARB和ARGs，而且能有效控制ARGs的傳播[6]。綜合比較發現，大多數病原生物和含ARGs的細菌在高溫堆肥過程中被自熱高溫迅速殺死，降低選擇壓力，改變微生物的群落結構進而使ARGs減少；好氧堆肥能有效降低畜禽糞便、抗生素菌渣等較高抗生素濃度的固體廢棄物中ARGs的多樣性和豐度，降低其在可耕地土壤中傳播的潛在風險，故好氧堆肥被認為是處理ARGs最有前途的方法之一。此外，好氧堆肥是處理富含ARGs的固體廢物用來生產高質量和穩定的土壤改良劑的有效方法，可以提高作物生產土壤的肥力，有利于實現其減量化、資源化和無害化。

本文從好氧堆肥對ARGs的消長影響的角度進行研究，分別從外源添加物如輔料、氯化鐵、零價納米鐵及生物菌劑等對ARGs消長影響的強化研究；并探討了好氧堆肥體系內重金屬和細菌群落對ARGs消長影響的主要因素。

1 外源添加物強化對ARGs消長的研究現狀

傳統、單一的好氧堆肥技術(圖1)已發展的較為成熟[1-2，7]，但易造成堆體營養成分損失、環境污染及對ARGs去除效率不理想且使部分基因富集。因此，目前大多數關于好氧堆肥過程中抗生素和ARGs處理的研究都是在外源添加物的條件下進行的。一般外源添加物主要分為輔料如木屑、秸稈、蘑菇渣、生物炭、氯化鐵、天然沸石等和生物菌劑如極端嗜熱微生物菌劑、抗生素降解菌等。

圖1 好氧發酵工藝流程圖Fig.1 Aerobic fermentation process route

1.1 輔料

在用畜禽糞肥堆肥過程中，通常都會添加輔料，因為它可以調節濕度和糞肥的碳氮比，使其達到最佳的堆肥條件，使堆肥溫度迅速升高[8]，提高好氧堆肥效率。通常添加的輔料一般有膨松劑、零件納米鐵、氯化鐵和生物菌劑等。

1.1.1 膨松劑 堆肥溫度的升高或高溫保留通常被認為是膨松劑(如稻草、生物炭、赤泥等)有利于抗生素降解[9]和去除ARGs的關鍵原因[10]；由于大多數抗生素在嗜熱條件下是不穩定的，故需要添加膨松劑，且膨松劑的材料多種多樣，加入后能夠促進堆肥腐熟進程，縮短堆肥周期，改善堆肥品質，減少有害氣體排放等，故最常用。

Qiu等[9]研究表明在堆肥中添加稻草和鋸末可以增加對堆肥后磺胺類抗生素殘留物的去除，可以增強抗生素的降解，抑制ARGs在糞肥中的擴散。Zhang等[11]比較了木屑、稻殼和蘑菇渣的三種原料和豬糞和雞糞進行堆肥，堆肥劑的添加提高了豬糞中抗生素14.9%～33.4%的去除率。在三種增菌劑中，木屑是兩種糞肥中去除抗生素最有效的促進劑，稻殼在降低雞糞中ARGs的效果最好。李靈章等[12]以玉米秸稈、水稻殼和雞糞、牛糞為原材料，兩兩組合進行高溫好氧堆肥。結果表明，雞糞+秸稈處理的溫度的峰值較高，持續高溫的時間更長；采用秸稈與雞糞或牛糞組合的堆肥腐熟度高，產物的營養性質和應用效果好，適合在農業生產中進行推廣和應用。張浩然等[13-14]分別從生物炭的應用進行了研究，發現生物質炭的豐富的孔隙結構和表面含氧官能團、比表面積大可顯著改善堆體的理化性質和生物學特性，進而有利于微生物的生存，促進礦化和腐殖化作用，進而調節了堆肥品質。Lu等[15]研究了在豬糞堆肥中添加不同比例的煤氣化爐渣(0，5%和10%)對ARGs的影響，發現添加10%的煤氣化爐渣能夠去除5/11的ARGs。Cao等[16]研究探討了在堆肥65 d后，三種添加水平(5%，10%，15%)的褐煤對雞糞堆肥中ARGs降解酶和細菌群落的影響，對照(不含褐煤)中ARGs的相對豐度降低了8.9%，褐煤處理(5%，10%和15%)中ARGs的相對豐度分別降低了15.8%，27.7%和41.5%。Zhang等[17]在污泥堆肥中添加天然沸石、添加3，4-二甲基吡唑磷酸鹽的硝化抑制劑(DMPP)對ARGs水平的影響進行對比實驗。結果表明，在反應器中加入DMPP和空白對照組后總ARGs的相對豐度分別富集了2.04倍和1.95倍。雖然有些ARGs(ermB、ereA和tetW)在污泥堆肥后減少了，但其他大部分ARGs在污泥堆肥后會增加。Peng等[18]研究在堆肥中添加沸石的ARGs的含量比不添加組減少了67.3%，且加入沸石的比加入過磷酸鈣的對照組降低了更多的ARGs和整合子，因此沸石有助于降低糞便中的ARGs。

不同輔料在不用底物堆肥的過程中對ARGs的去除效果不同，其次相同輔料不同含量對ARGs的去除效果也不同。由上可知，在好氧堆肥中添加生物炭、天然沸石、木屑秸稈等會明顯降低污泥堆肥中ARGs的相對豐度，降低其環境風險，提高了堆肥的品質。其中沸石對降低ARGs的豐度效果最優，其次是木屑。稻殼對降低雞糞中ARGs的相對豐度效果最優。在一定程度上會降低含較高濃度的抗生素的固體廢物中的ARGs的總相對豐度，主要是由于細菌群落的變化影響了ARGs的變化。由于抗生素種類不同，添加輔料后部分ARGs減少，但仍有一部分ARGs不同程度的增多。因此，有必要追究堆料來源和堆肥是否影響土壤中固體廢棄中承載的ARGs的命運，特別是在長期施肥歷史不同的情況下。

1.1.2 零價納米鐵和氯化鐵 鐵元素對人類身體健康有重要影響，含鐵的肥料使土壤含量豐富，使農作物中的含鐵量增加，被人類食用后利于補充人類所需的物質。又因為氯化鐵、零價納米鐵自身特點，通過對作物進行吸附、氧化等作用常被用于去除水中、土壤中的各種污染物。諸多科研人員研究了將氯化鐵、納米鐵加入好氧堆肥后促進堆肥微生物的生長和對ARGs消長的影響等。

Guo等[19]研究了在堆肥中添加氯化鐵，提高了堆肥過程中微生物的活性，減少了ARGs的富集，有利于ARGs的去除，表明氯化鐵可以降低堆肥產品中膜轉運和信號轉導分子的豐度。表明加入氯化鐵可能會抑制堆肥中ARGs的轉移。Wang等[20]研究了在堆肥中添加0，100，1 000 mg/kg的零價納米鐵對豬糞堆肥過程中ARGs和MGEs的影響，堆肥后sul1、sul2、dfrA7、ermF和ermX的相對豐度分別下降了33.26%和99.31%，intI2和Tn916/1545的相對豐度分別下降了95.59%和97.65%。Ma等[21]證明了零價納米鐵可以顯著改善四環素的降解，在大多數系統中去除率超過90%。

諸多研究發現在堆肥中添加零價鐵、氯化鐵等，有利于ARGs的去除。由于微生物是ARGs的主要載體，微生物群落的演替明顯影響ARGs的命運。在零價納米鐵添加量不同時，微生物群落的變化不同，微生物群落的差異也影響ARGs的命運。綜上所述，零價納米鐵和氯化鐵可以作為一種環境友好的添加劑，通過影響MGEs而降低堆肥中ARGs的相對豐度；尤其在100 mg/kg的零價納米鐵對四環素類中的ARGs的去除效果最優，對后續強化好氧堆肥對ARGs的去除效果的研究提供了一種思路，確定了多種常見且易難去除的ARGs及其細菌群落的影響之間的關系，為今后的實際應用提供了理論基礎。

1.2 生物菌劑

在實驗室條件下評估堆肥過程中殘留的抗生素和ARGs，傳統方法往往無法從堆肥最終產品中去除ARGs[22-23]。傳統的好氧堆肥對ARGs的去除效果不理想；又因為好氧堆肥中有豐富的微生物，可通過增加堆肥過程中的微生物活性來促進堆肥的成熟，此方法也逐漸被廣泛應用。

巨大芽孢桿菌作為一種眾所周知的溶磷接種劑已廣泛用于農業和肥料制造[24-25]。Guo等[19]研究了在堆肥中添加微生物菌劑，增加了堆肥中微生物的種類和活性，有利于堆體中的ARGs的去除；Yang等[26]在堆肥中添加復合微生物菌劑后可提高高溫分解溫度，延長高溫分解周期4 d。與對照相比，接種復合菌劑可使纖維素酶、脲酶和多酚氧化酶活性分別提高15.0%～19.8%，2.3%～71.4%和0.3%～28.4%。

由于傳統的好氧堆肥的溫度不夠高，一般最高在50～70 ℃內，不能有效地去除所有病菌和ARGs。現已有大量研究表明提高堆肥溫度可以顯著縮短堆肥的發酵周期，加快堆肥腐殖化進程。2008年，日本科學家Oshima在傳統污泥堆肥中添加極端嗜熱微生物，在自然條件下使堆體溫度達到90 ℃以上，可大大縮短堆肥周期、提高堆肥腐熟轉化效率[27-28]。Liao等[29]探討長期(不少于6 d)暴露于60 ℃以上的超高溫堆肥，去除泰樂菌素抗生素發酵殘留物(TFR)的95.0%和75.8%的相關ARGs和移動遺傳元素(MGEs；質粒、整合子和轉座子)的98.5%，反映出超嗜熱堆肥通過減少抗生素抗性質粒和相關宿主細菌的豐度，有效地從抗生素發酵廢物中去除相關的ARGs。

總之，添加復合菌劑提高了堆肥過程中細菌群落的多樣性，從而促進了細菌群落結構的演替，提高了堆肥的質量和效率；縮短了堆肥過程的持續時間，提高了腐熟率；提高了纖維素酶、脲酶和多酚氧化酶的活性水平。通過添加極端嗜熱菌后的超高溫堆肥在去除抗生素和抗生素殘留物、重金屬和相關的ARGs和MGEs是高效的；同時表明，超嗜熱堆肥是一種在工業規模上處理高濃度抗生素發酵廢物的成功策略，對與多重耐藥質粒相關的細菌宿主具有負面影響；超高溫堆肥縮短了堆肥時間，使ARGs的相對豐度大大降低。

2 好氧堆肥中影響ARGs遷移的主要因素

在堆肥過程中，細菌群落(包括ARGs和MGEs的宿主)隨著物理化學因素(如營養物質)的變化而發生顯著變化，并導致其攜帶的ARGs和MGEs的變化。經調查發現重金屬、細菌群落對ARGs在較高濃度抗生素中的廢棄生物質的影響。堆肥處理顯著改變了細菌群落的豐度、組成和多樣性，去除部分ARGs和MGEs的相對豐度，但仍有大部分ARGs的總豐度增加。

2.1 重金屬

然而，銅、鋅等重金屬是促進生長和提高飼料效率的重要元素，然而重金屬在動物腸道中的吸附性很差，大部分銅在尿液和糞便中的排泄沒有變化，故在畜禽糞便、抗生素菌渣中大量存在。繼而使其進行堆肥，重金屬留在堆肥產品。又因為重金屬在堆肥過程中不能被降解，因此可能在抗生素耐藥性的擴散中造成持續的共選擇壓力。由于有些鈍化劑中存在重金屬，導致ARGs中的重金屬含量較高，導致環境中更高的潛在風險。

Yin等[30]指出在堆肥過程中，多種重金屬特別是銅和鋅AFDs和堆肥原料中所含的重金屬會影響ARGs、金屬抗性基因(MRGs)和微生物群落組成，并指出重金屬使ARGs的豐度升高。Qian等[31]對三種典型的鈍化劑(生物炭、粉煤灰和沸石)應用于富含銅豬糞的堆肥過程中，所有鈍化劑處理比空白組降低了至少6種ARGs和2個MGEs的26%～85%。但銅抗性基因的豐度沒有被鈍化劑降低，這意味著降低銅的共選擇壓力可能不是ARGs降低的主要原因。Zhang等[32]研究采用不同銅添加濃度的泰樂菌素發酵殘渣和污泥好氧堆肥，結果表明，兩種濃度的銅不僅影響非生物因子，而且影響抗性基因的相對豐度。高濃度銅抑制微生物群落的代謝能力和固氮過程，ermT、mefA、MfA的豐度增加部分歸因于MRGs反映的重金屬的毒性效應和共選擇壓力。Wu等[33]發現ARGs、MRGs和MGEs主要受環境因子和微生物群落共同作用的驅動。在堆肥樣品中檢測到了不同的金屬硫蛋白，這些金屬硫蛋白對砷、鎘、鈷、鋅、銅、汞、鉛和碲等重金屬具有抗性。這意味著，特定重金屬施加的選擇壓力可能并不總是導致目標基因的相應變化，因為MRGs的變化是由多種因素驅動的，如MGEs和細菌群落。

Sun等[34]探討了紅霉素菌渣(EMW)和豬糞以0(對照)、5%(低)和20%(高)的比例混合堆肥后，大多數處理的erm基因相對豐度(RAs)降低了 77.75%～99.97%。高EMW對erm基因的去除有負面影響，與對照和L組相比加劇了ARGs的富集，說明Zn的濃度到一定值后對ARGs有了促進的作用。Peng等[35]研究探討了豬糞和綠茶殘渣(GTRs)進行混合堆肥后，GTRs的添加有效地促進了大多數靶向ARGs(tet和sul基因)、可移動遺傳元件(MGEs，intI1)，以及金屬抗性基因(MRGs，pcoA和tcrB)的減少。經網絡分析表明，厚壁菌門和放線菌門是ARGs的主要宿主，MGEs和MRGs共享相同的潛在宿主菌，GTRs影響細菌群落，從而影響ARGs分布的變化，降低與堆肥產品相關的潛在風險。

綜上所述，重金屬對糞肥、菌渣等含較高濃度抗生素的固體廢棄物中ARGs的影響未有明確的去除結論，在不同濃度不用種類的金屬中對ARGs的去除效果可能有呈正相關，可能會有逆相關；又由于ARGs的變化由多種因素決定，重金屬對ARGs的影響僅是一方面。重金屬銅、鋅和ARGs等環境因子之間存在顯著相關性。研究發現銅的添加顯著增加了部分ARGs的總豐度(3種ARGs的豐度顯著高于未添加銅組)，說明銅可以引起堆肥過程中部分ARGs的變化。此外，在不同濃度的銅下，ARGs的豐度也存在顯著差異，這說明銅會增加ARGs的生態風險。研究表明ARGs的進化受其細菌宿主的極大影響，添加銅、鋅等重金屬可以在某種程度上驅動這些抗性基因中細菌宿主的選擇，這也可能抑制宿主對特殊環境的適應，且重金屬的存在減少了堆肥系統中細菌的群落結構。因此，由于長期的共選擇壓力，ARGs的傳播可能會增加。銅、鎳、鋅等重金屬都是對大多數抗生素具有抗性的菌株的潛在的共選擇劑，并且由于許多病原體攜帶ARGs和MRGs，增強了潛在的共選擇功能；濃度不同的銅處理組之間intI1均顯著增加，這表明重金屬可能影響ARGs并增加共復合過程中的生態風險。因此，重金屬的存在需要共堆肥過程中加以控制。

2.2 細菌群落

大量研究表明，微生物被認為是ARGs傳播的主要載體，ARGs的變化受到微生物演替的顯著影響[36-37]，因此，細菌群落演替可能是所有混合堆肥條件下ARGs不同命運的主要驅動力。不同ARGs的差異可能歸因于不同的細菌；在混合堆肥過程中，ARGs剖面的變化與細菌群落的組成之間有很強的關系，即微生物的多樣性和結構是影響不同環境(如河流、土壤、污水污泥和地下水)中ARGs動態的關鍵生物因素。ARGs在堆肥中的動態見圖2。

圖2 堆肥后的ARGs流程圖Fig.2 Flow chart of ARGs after composting

Li等[38]說明了單個ARGs和微生物分類群(基于前20個屬)之間的詳細關系，表明不同ARGs的差異可能歸因于不同的細菌及ARGs的變化與細菌群落的組成之間有很強的關系。SARDAR等[39]在堆肥中發現，細菌多樣性發生了顯著變化。Cao等[40]發現在堆肥中細菌群落在門和屬水平上呈現出顯著的時間變化，在網絡分析中總共發現了123個正相關，包括52個強相關。一些ARGs與同一屬呈正相關，這進一步證明了在堆肥過程中多種ARB的存在和ARGs的共存。

總之，在好氧堆肥過程中含有頻繁的HGT過程、多種ARGs宿主、多種ARB和ARGs的共存，而ARGs與理化因子之間的相關性較弱，這意味著潛在的健康和環境風險。不同的ARGs與同一宿主菌之間的正相關，表明了不同的ARGs的共存，進一步得出細菌群落對ARGs進化的主要影響。研究發現細菌群落與ARGs的豐度顯著相關，微生物群落對混合堆肥過程中ARGs的變化有影響。在不同處理下堆肥對微生物群落結構有顯著影響，并且在混合堆肥過程中觀察到放線菌和變形菌相對豐度的降低，進而混合堆肥過程中部分ARGs的去除。堆肥過程中與細菌群落相關的ARGs分布，在不同階段的細菌群落中發現了相似的ARGs時間模式，這證實了細菌群落組成與ARGs密切相關，即ARGs的變化受到微生物演替的顯著影響。因此，細菌群落演替可能是所有混合堆肥條件下ARGs不同命運的主要驅動力，如果ARGs和共存的微生物群落具有顯著的正相關性，那么微生物群落和ARGs之間的共生模式可用于發現對ARGs及其可能宿主的新想法。細菌群落與ARGs的相關性表明細菌群落在控制ARGs變異中起重要作用。驅動ARG流行的關鍵因素包括它們的宿主細菌(假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬和鹵菌屬)和堆肥變量(總有機碳、總氮、氨氮和酸堿度)。這些發現為更好地控制抗生素菌渣、畜禽糞便中的ARGs提供了思路。進一步的工作可以篩選功能性微生物以提高堆肥過程中ARGs的去除。

3 結論與展望

ARGs作為一種新型污染物，用好氧堆肥處理ARGs，已取得顯著效果且應用廣泛。通過外源添加物促進好氧堆肥已逐漸成熟，現如今用含較高抗生素濃度的抗生素菌渣、畜禽糞便、污泥等作為底料進行堆肥研究較多且對ARGs的去除效率較好；而不同重金屬不同濃度下的對多種ARGs的影響效果不同；對不同的ARGs與同一宿主菌之間的正相關，表明了不同的ARGs的共存，進一步得出細菌群落對ARGs進化的主要影響。本文在眾多研究成果的基礎上，展望如下：

(1)進一步探究如何提高抗生素菌渣好氧堆肥去除ARGs的效率，并對其工藝條件進行優化、抗生素降解菌的分離以及探索低成本材料的應用。

(2)不同重金屬不同濃度下的對多種ARGs的影響效果不同，進一步研究重金屬對眾多ARGs的影響因素及機理。

(3)通過外源添加物促進好氧堆肥已逐漸成熟，然而由于ARGs與重金屬、HGT、MGE及細菌群落的復雜的關系還未明確。好氧堆肥體系內微生物群落的變化是ARGs消長的主要驅動因子，確定ARGs的潛在宿主菌是目前研究的難點，后期應進一步明確和分析ARGs變化的機理和確定ARGs的潛在宿主菌。