腸炎清對潰瘍性結(jié)腸炎大鼠TGF-β1/Smad3/ERK通路的影響

詹原泉 叢龍玲 呂永慧 黃雅靜 謝英杰 周婉妃 吳宇金

(1 廣州醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃科，廣州，510130；2 廣東省人民醫(yī)院，廣州，510000；3 廣州中醫(yī)藥大學，廣州，510405)

潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis，UC)屬于一種炎癥性腸病，是病因尚不明確的結(jié)直腸慢性非特異性炎癥性疾病[1]。UC復發(fā)率高且預后差，有效治療UC給臨床帶來了極大的挑戰(zhàn)。近年來，遺傳學、免疫學、細胞生物學、分子生物學等學科迅速發(fā)展，尤其是關于細胞因子、黏附因子、核因子κB及Toll樣受體等的研究，為揭示UC的發(fā)病機制提供了大量有價值且可靠的線索，并已成為開發(fā)新治療藥物的強有力的理論依據(jù)。但是，目前對UC的發(fā)病機制還沒有完全清楚。本研究采用動物實驗的方法，觀察腸炎清對大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的保護作用并對其機制進行研究，以期為腸炎清的臨床推廣應用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 購入南方醫(yī)科大學實驗動物中心無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠，雌性，6～8周齡，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2015-0001，動物使用許可證號：SYXK(粵)2015-0150，倫理審批號：STUDY111。大鼠給予標準鼠維持飼料，自由飲用純凈水，每日換水，動物墊料采用白楊木片，購自廣州市賽柏諾生物科技有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境室溫20～26 ℃，濕度40%～70%，12 h明暗交替。動物入室實驗前先檢疫適應環(huán)境5～7 d，選擇健康動物作為受試動物。

1.1.2 藥物 腸炎清(廣州醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院，批號：粵藥制字Z06022718)，150 mL/袋；美沙拉嗪緩釋顆粒(艾迪莎)(上海愛的發(fā)制藥有限公司，批號：161118)，0.5 g/袋。

1.1.3 試劑與儀器 模型誘導劑2,4,6三硝基苯磺酸(2,4,6-Trinitrobenzene Sulfonic Acid,TNBS)(Sigma公司，美國，批號：SLBT1675)；信號轉(zhuǎn)導蛋白(Smad2/3)(Cell signaling公司，美國，貨號：5678S)；磷酸化胞外信號調(diào)節(jié)激酶(p-Extracellular Rignal-regulated Kinase，ERK)(Cell signaling公司，美國，貨號：8544S)；胞外信號調(diào)節(jié)激酶(erk)(Cell signaling公司，美國，貨號：4370T)；轉(zhuǎn)化生長因子-β1(Transforming Growth Factor,TGF-β1)(abcam公司，英國，貨號：ab92486)；脫水機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JJ-12J)；包埋機(武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-P5)；凍臺(武漢俊杰電子有限公司，型號：JB-L5)；病理切片機(上海徠卡儀器有限公司產(chǎn)品，型號：RM2016)；組織攤片機(金華市科迪儀器設備有限公司，型號：KD-P)；烤箱(萊玻瑞儀器設備有限公司，型號：GFL-230)；正置光學顯微鏡(日本尼康公司，型號：Nikon Eclipse E100)；成像系統(tǒng)(日本尼康公司，型號：NIKON DS-U3)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 按照體質(zhì)量將25只大鼠隨機分為空白對照組(溶媒對照組)、模型組、美沙拉嗪組(陽性藥物組)、腸炎清低劑量組和腸炎清高劑量組，每組5只。除空白對照組外，其余大鼠均采用TNBS誘導建立UC模型；造模當日以50 mg/kg TNBS乙醇溶液灌腸。

1.2.2 給藥方法 造模24 h后，模型組、空白對照組大鼠分別以0.9%生理鹽水灌胃；美沙拉嗪組以30 mg/kg艾迪莎混懸液灌胃；腸炎清高劑量組以147.2 g/kg腸炎清灌胃；腸炎清低劑量組以36.8 g/kg腸炎清灌胃；1次/d，時間固定，持續(xù)7 d。藥物(生理鹽水)干預結(jié)束后，所有動物采用戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉后，對動物實施安樂死后進行組織取材，采集結(jié)直腸即肛門到盲腸下端段，長度約12 cm。

1.2.3 檢測指標與方法 1)觀察各組大鼠從給藥第1天至第8天的一般形態(tài)、體質(zhì)量的變化；2)觀察各組大鼠給藥后第8天的大體解剖；3)觀察大鼠腸道組織病理變化：取大鼠腸道組織，石蠟包埋固定，分別進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin Eosin，HE)染色及免疫組織化學染色；對HE染色及免疫組織化學染色切片進行顯微圖像采集分析，觀察大鼠組織病理情況。4)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測大鼠結(jié)腸黏膜組織中TGF-β1、Smad3水平、ERK磷酸化的水平及TGF-β1信號通路活化的程度。以含蛋白酶抑制劑的裂解液提取大鼠組織總蛋白，布拉德福德(Bradford)法蛋白定量；90 mA恒流十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecylsulfate，SDS)電泳，90 V恒壓轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，麗春紅染色，根據(jù)Marker條帶位置和目的蛋白大小剪膜；含5%脫脂奶粉和TBST封閉液常溫封閉膜1 h；4 ℃孵育1抗過夜，TBST洗膜10 min 3次，常溫孵育2抗1 h；TBST洗膜10 min 3次，ECL法發(fā)光，圖像掃描分析；檢測大鼠結(jié)腸黏膜組織中TGF-β1、Smad3、ERK磷酸化的水平。5)以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應法檢測組織細胞中ERK1/2 mRNA的表達：提取大鼠中細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用寡脫氧胸腺苷酸(Oligodeoxythymidylic Acid，Oligo)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進行PCR擴增，而獲得ERK1/2 mRNA的表達。聚合酶鏈反應條件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，72 ℃，30 s，45個循環(huán)。溶解曲線：65 ℃ 30 s。每個樣本各重復3次，擴增結(jié)束，記錄Ct值，按照2-△△Ct法對檢測結(jié)果進行統(tǒng)計分析。測定ERK表達水平基因引物序列見表1。

表1 測定ERK表達水平基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組動物一般狀態(tài)觀察 造模給藥期，空白對照組未見明顯異常；模型組、美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組造模后，所有動物均出現(xiàn)稀便，部分動物出現(xiàn)肛門周血跡。開始給藥后，模型組部分動物出現(xiàn)嚴重腸道反應、明顯消瘦，部分動物腸道反應減輕，有自愈跡象。腸炎清低劑量組和模型組類似，但后期腸道反應緩解。美沙拉嗪組和腸炎清高劑量組動物腸道反應明顯緩解，僅腸炎清高劑量組個別動物出現(xiàn)腸道梗阻，可能與前期炎癥反應導致腸道糞便阻塞所致。但緩解率明顯優(yōu)于腸炎清低劑量組。

2.2 各組動物體質(zhì)量比較 造模后空白對照組動物體質(zhì)量呈正常增長趨勢；模型組、美沙拉嗪組和腸炎清低劑量組和腸炎清高劑量組造模后動物體質(zhì)量明顯減輕，與動物嚴重的腸道反應相關，腸炎清高劑量組在給藥后期動物體質(zhì)量略有恢復，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組動物體質(zhì)量比較

2.3 各組動物大體解剖觀察 給藥后第8天動物實施安樂死，大體解剖觀察，空白對照組動物未見明顯異常；模型組、美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組大腸段可見明細擴張，結(jié)腸腸壁增厚，結(jié)腸段內(nèi)膜可見不同程度潰瘍，模型組最為嚴重，其次是美沙拉秦組和腸炎清低劑量組，腸炎清高劑量組潰瘍面減小，潰瘍程度減弱。與模型組比較，美沙拉嗪組、腸炎清低劑量組和高劑量組結(jié)腸損傷面積和損傷程度有明顯減小；與美沙拉嗪組比較，腸炎清組低劑量組結(jié)腸損傷面積和損傷程度沒有明顯差異，而腸炎清高劑量組差異顯著，對結(jié)腸損傷面積和損傷程度有明顯緩解作用。見圖1。

圖1 各組大體解剖觀察

2.4 各組動物病理學檢查結(jié)果及評分 結(jié)腸段組織病理學檢查結(jié)果顯示，空白對照組未見明顯異常。模型組可見黏膜及黏膜下層腸壁壞死，并可見大量中性粒細胞浸潤，平均組織病理評分3.3分;美沙拉秦組可見黏膜固有層壞死，伴有大量中性粒細胞浸潤，平均組織病理評分2分；腸炎清低劑量組可見黏膜層壞死，大量中性粒細胞浸潤，壞死區(qū)域可見鈣化灶，平均組織病理評分2.3分；腸炎清高劑量組可見黏膜層壞死，部分動物可見下層輕度壞死，大量中性粒細胞浸潤，平均組織病理評分2分。從組織病理學檢查結(jié)果分析，與模型組比較，美沙拉秦組和腸炎清高劑量組對結(jié)腸損傷有明顯改善作用，腸炎清低劑量組對結(jié)腸損傷有一定改善作用。見圖2、表3。

圖2 各組組織病理學檢查結(jié)果(HE染色，×100)

表3 各組大鼠組織病理學評分和通路分析

2.5 大鼠結(jié)腸黏膜組織中ERK磷酸化的水平及TGF-β1信號通路活化的程度 模型組p-ERK和ERK表達水平最低，并且腸炎清組p-ERK和ERK表達水平隨劑量升高而上升，且高劑量腸炎清組p-ERK表達水平顯著高于模型組，2組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；高劑量腸炎清組p-ERK表達水平與美沙拉嗪組(陽性藥組)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3～4。

圖3 各組ERK磷酸化電泳結(jié)果

圖4 各組ERK磷酸化比較

2.6 大鼠腸黏膜TGF-β1、Smad3水平及TGF-β1信號通路活化的程度 (TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3)實驗結(jié)果顯示，模型組TGF-β1和p-Smad2/3明顯高于美沙拉嗪組(陽性藥組)、空白對照組和腸炎清觀察組(P<0.05)。見圖5～6。

圖5 各組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3電泳結(jié)果

圖6 各組TGF-β1、p-Smad2/3、Smad2/3比較

3 討論

腸炎清是廣州醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)制劑，2010年評為廣州市中醫(yī)藥學會優(yōu)秀制劑，在應用治療已知或未知原因引起的腸黏膜損傷的20年中，療效顯著。然而在前期動物實驗研究發(fā)現(xiàn),腸炎清對UC大鼠模型結(jié)腸黏膜ERK1、ERK2基因的相對表達量有上調(diào)作用，提示腸炎清治療作用可能與ERK信號轉(zhuǎn)導通路被激活有關[2-4]。在TGF-β1發(fā)揮其生物學效應時，促分裂原活化的蛋白激酶信號通路是其中的一個重要通路，且Smad3是TGF-β的關鍵始動因子。研究表明，在多種細胞中,TGF-β1/Smad3與ERK信號轉(zhuǎn)導通路可能存在多個環(huán)節(jié)有相互調(diào)節(jié)關系[5]，但其具體作用機制及關鍵環(huán)節(jié)還不明確。本研究通過觀察TGF-β1、Smad3、ERK三者關系，發(fā)掘腸炎清治療機制的作用靶點及途徑，為UC的治療提供新方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過大鼠大體解剖觀察病理組織，腸炎清對腸道有一定的修復作用，且高劑量的腸炎清改善結(jié)腸損傷的療效等同于美沙拉嗪組，對腸道炎癥起到明顯修復作用。

TGF-β1在炎癥和組織修復過程中起了重要作用[6]。TGF-β1是一種調(diào)節(jié)細胞生長及分化的抗炎細胞因子，具有多種生物學活性，能抑制淋巴細胞增殖及其功能，并且抑制巨噬細胞激活[7]。同時它又屬于免疫抑制劑，能減輕局部炎癥反應，主要通過抑制T、B細胞增殖，可減少主要組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)Ⅱ類抗原表達。Smads家族蛋白在將TGF-β信號從細胞表面受體轉(zhuǎn)導至細胞核的過程中起到關鍵性作用，Smads蛋白是一種中介分子，能將配體與受體作用的信號從胞質(zhì)傳遞到細胞核內(nèi)，而活化的Smads進入細胞核內(nèi)可同時抑制或激活它們調(diào)節(jié)的靶基因轉(zhuǎn)錄[8]。Smads家族成員是TGF-β下游的信號蛋白分子，而Smad3是這一信號通路的關鍵始動因子[8]。在TGF-β信號轉(zhuǎn)導通路中，Smads家族作為下游的重要信號蛋白分子，為TGF-β信號從細胞外轉(zhuǎn)導到細胞核內(nèi)的重要部分，其中尤以Smad3最為關鍵，能在整個信號通路中發(fā)揮著極其關鍵的作用[9]。TGF-β1/Smad3信號通路調(diào)控免疫反應[10-11]，可通過誘導細胞外基質(zhì)成分膠原蛋白和黏蛋白的合成，減少細胞外膠原蛋白分解酶的釋放，促進纖維化形成，有益于損傷組織的纖維化修復[12-15]。但在本實驗中，通過蛋白質(zhì)印跡法得出的結(jié)果與有關研究報道不同，提示TGF-β1為化學趨化因子，對單核細胞具有促炎作用，可加重腸道炎癥，與有些研究結(jié)果相似?？紤]TGF-β可通過黏附分子將單核細胞募集到造模后受傷的腸道，同時通過誘導單核細胞IL-1、IL-6和白三烯C4合成酶加強炎癥反應[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組中TGF-β1/Smad3明顯升高，而觀察組中TGF-β1/Smad3都降低明顯，考慮美沙拉嗪組及腸炎清組對TGF-β1/Smad3信號通路有明顯的抑制作用，且腸炎清高劑量更加明顯，提示腸道損傷炎癥反應程度與TGF-β1/Smad3的表達負相關。

促分裂原活化的蛋白激酶信號通路是TGF-β1發(fā)揮其生物學效應的一個重要通路[18]。作為促分裂原活化的蛋白激酶的重要成員之一，ERK是組成從細胞膜到細胞核的細胞信號系統(tǒng)之一，通過調(diào)控細胞增殖及細胞凋亡，參與細胞的生物學過程。國內(nèi)多項研究發(fā)現(xiàn)，ERK指標與細胞增殖有關，表達水平升高代表細胞增殖活躍[19-21]。本實驗中腸炎清組該指標水平隨劑量升高而上升，且高劑量腸炎清組p-ERK表達水平顯著高于模型組，并與陽性藥組(美沙拉嗪組)比較差異無統(tǒng)計學意義，表明高劑量腸炎清可能有利于腸炎病理狀態(tài)下的組織修復。治療后，腸炎清高劑量組及美沙拉嗪組在炎癥修復中p-ERK表達水平超過空白對照組，表明p-ERK升高更有利于炎癥改善。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組TGF-β1和p-Smad2/3明顯升高，而p-ERK明顯減低；而治療各組中TGF-β1和p-Smad2/3明顯減低，而p-ERK明顯升高，二者具有可比性。從結(jié)果中提示TGF-β1/Smad3信號通路與ERK負相關，提示腸炎清可通過下調(diào)TGF-β1/Smad3信號通路，提升ERK水平而發(fā)揮炎癥修復作用。故通過信號通路的調(diào)控機制入手，深入研究中藥腸炎清治療UC的作用機制及相關新信號通路，可為UC治療新藥的開發(fā)提供新思路。