正交試驗優選羽扇豆醇提取工藝及液相色譜法-質譜法聯用(LC-MS)與氣相色譜法-質譜法聯用檢測比較

任天和 潘年松 羅 俊

(1 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽，550004；2 遵義醫藥高等專科學校，遵義，563006)

馬棘(Indigofera Pseudotinctoria)是豆科，木藍屬小灌木。主要分布于云南、貴州、四川、湖南、湖北等地，也是優質的青飼料[1]。有研究發現在馬棘提取物石油醚層鑒定出羽扇烯酮，在同豆科的截葉鐵掃帚中，測得羽扇烯酮和羽扇豆醇含量均為主要成分[2-3]。羽扇豆醇屬于五環羽扇豆烷型三萜類化合物，廣泛存在于無花果、葡萄、大豆等多種水果蔬菜中，具有抗腫瘤、抗氧化、降糖、抗炎、護肝等藥理活性[4-5]。

氣相色譜法-質譜法聯用(Liquid Chromatograph-mass Spectrographyr，LC-MS)和氣相色譜法-質譜法聯用(Gas Chromatography-mass Spectrography，GC-MS)均有很高的靈敏度與專屬性，結合質譜對不同離子的響應，可以快速定性分離化合物成分信息。在眾多領域有廣泛的應用，在代謝組學中更是互為補充[6]。

1 材料

1.1 樣品及標準品 馬棘種子(遵義綠普森農業科技開發有限公司)；羽扇豆醇標準品(成都普思生物科技股份有限公司，生產批號：PS020067)。

1.2 儀器 液質聯用儀(AB，美國，型號：SCIEX 4000Q trap LC-MS/MS)；LC色譜柱(AcclaimTM，美國，型號：120 C18 4.6 mm×150 mm 5 μm)；氣質聯用儀(Thermo ScientificTM，美國，型號：ISQTM7000單四極桿GC-MS)；GC色譜柱(Thermo，美國，型號：TG-5MS 30 m×0.25 mm×0.25 μm)。

2 方法

2.1 單因素試驗

根據現有文獻[7-11]報道，選取溶劑與時間2個因素，進行馬棘種子提取單因素試驗，烘干溶劑得浸膏。通過LC-MS檢測計算羽扇豆醇含量。

2.1.1 LC-MS含量檢測 標準品及樣品制備：精密稱取4.0 mg樣品，溶解于1 mL甲醇中，超聲溶解，過0.22 μm濾膜，4 ℃保存備用。精密稱取1.0 mg標準品，溶解于1 mL甲醇中，配成1 mg/mL濃度，過0.22 μm濾膜。并依次稀釋至320 μg/mL、32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL，4 ℃保存備用。

2.1.2 LC-MS條件 流動相：0.1%甲酸甲醇(0.1%甲酸水=90∶10)，進樣量：1 μL，流速：0.8 mL/min。羽扇豆醇的準確分子質量：426.4，母離子：453.2，子離子：435.4，DP：102，CE：32。

2.2 正交試驗

以單因素試驗為基礎，設計三因素三水平正交試驗。烘干樣品后通過GC-MS檢測分析羽扇豆醇最佳提取方案及影響因素。見表1。

表1 羽扇豆醇浸提工藝因素水平

2.2.1 GC-MS成分檢測 標準品及樣品制備：精密稱取各樣品20 mg，溶于1 mL乙醚中，震蕩溶解后過0.45 μm濾膜，4 ℃保存備用。精密稱取1.0 mg標準品，溶解于1 mL乙醚中，過0.45 μm濾膜，4 ℃保存備用。

GC-MS條件：根據唐超等[3]試驗方法稍作調整，初始溫度40 ℃，保持1 min，以30 ℃/min升溫至260 ℃，保持1 min，再以15 ℃/min升溫至280 ℃，保持10 min；氣化室溫度250 ℃；離子源溫度300 ℃；進樣口溫度280 ℃；載氣為高純度氦氣；體積流量：1.0 mL/min；離子化模式：EI；電子能量：70 eV；溶劑延遲：12 min。質譜掃描范圍：m/z 40～500。

2.2.2 羽扇豆醇定性及半定量分析 通過LC-MS檢測，對相同工藝提取的GC-MS檢測結果峰面積進行等量代換，并對LC-MS檢測的其他峰面積進行推導計算含量(M：浸膏總重；Y：稱取重量)。

3 結果

3.1 LC-MS檢測單因素分析 LC-MS檢測結果計算含量顯示，羽扇豆醇在10倍液料比情況下比較溶劑與浸提時間2個因素。石油醚、浸提5 d、10倍液料比情況下羽扇豆醇含量最高。見表2。

表2 單因素實驗結果

3.2 GC-MS檢測正交試驗分析

3.2.1 定性分析 如圖1所示羽扇豆醇標準品A(18.37)與樣品B的保留時間大致相同，向樣品中加入標準品后出峰時間C(18.29)稍有提前。

表3 GC-MS半定量推導含量

采用中位數檢驗，正交實驗排除第27號工藝后，對剩下26份數據按照羽扇豆醇含量降序排列，若數據為偶數，則中位數選取最中間2個數據(即第13號和第14號)，求得其平均值，即中位數值為4 503.66 μg；工藝分別為95%乙醇、15 d、10倍液料比和95%乙醇、10 d、5倍液料比。根據降序排列可以看出最大提取含量工藝為石油醚，5 d、5倍液料比，最小值為95%乙醇、5 d、5倍液料比。且羽扇豆醇含量前25%基本均為石油醚作為溶劑所提取的工藝。

表4 LC-MS與GC-MS相同工藝下羽扇豆醇峰面積及含量

表5 LC-MS與GC-MS相同工藝檢測結果Wilcoxon符號秩和檢驗結果

4 討論

采用提取方法包括水浴、熱回流、超聲、超臨界萃取等[12-16]，溶劑包括乙醇、甲醇、氯仿等浸膏中均檢測出羽扇豆醇[14-15,17]。但在高婷[14]的研究提到對山楂采用超聲提取羽扇豆醇，并對溶劑(氯仿、甲醇、80%乙醇)及用量與超聲時間進行單因素考察發現，在40 mL氯仿中超聲45 min時提取效果最佳；并在枸骨葉中提取羽扇豆醇也通過單因素考察了溶劑(氯仿、乙酸乙酯、甲醇)及用量與提取方法[18]，最后發現用20 mL甲醇在40 ℃水浴16 h后超聲30 min時提取率最佳。本實驗設計三因素三水平正交實驗，對馬棘種子提取羽扇豆醇的工藝進行研究，采用了溶劑(95%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)、時間(5 d、10 d、15 d)、液料比(5倍、10倍、20倍)3種因素對馬棘種子進行提取率考察。以提取羽扇豆醇含量從大到小排序發現，其中含量前25%均為石油醚作為溶劑提取，但第27號樣品因石油醚提取，導致油脂含量過高，羽扇豆醇無法準確被檢測。初步確定最佳工藝為石油醚、5倍液料比浸提5 d。但石油醚具有毒性，且難以回收，考慮對環境污染，及工業化大生產，不作為優選考慮的溶劑。排除石油醚對應的組別后，乙醇與乙酸乙酯相互交替，未見明顯區別。根據單因素實驗中采用95%乙醇提取，基本比乙酸乙酯作為溶劑提取率更高，且乙醇易回收，因此選取95%乙醇作為溶劑，在比較正交實驗中，也同時與單因素實驗結果相聯系。綜合上述考慮后得出馬棘提取羽扇豆醇工藝為95%乙醇、15 d、10倍液料比。

此外，對于LC-MS與GC-MS檢測結果的比較，在對肝臟及血清樣本的分析中，GC-MS比LC-MS多分離鑒定出50%的化合物[19]。且在檢測生物檢材中甲基異柳磷在LC-MS對樣品的處理比GC-MS檢測更為煩瑣[20]。對丙烯酰胺的含量檢測中發現GC-MS/MS和LC-MS/MS 2種方法都具有定量限低、精密度好的特點[21]。但在相關文獻中并沒有對2種檢測方法結果的比較。而本實驗采用了在相同工藝下的樣品，用LC-MS所測的含量與GC-MS峰面積進行比較，推導其GC-MS所測羽扇豆醇的含量計算公式，以計算正交實驗中羽扇豆醇含量的方法。本實驗首次嘗試了對LC-MS與GC-MS所測實驗結果進行比較及推導的方法，所計算結果沒有統計學意義(P>0.05)，但不同溶劑間對應的比值有所差異。GC-MS一般是定性某成分的有無，不作為定量依據，其優點是一次檢測可以獲得很多種物質的信息，其缺點是定量不準確。LC-MS值一般是作為定量依據，其優點是定量準確，其缺點是1次只能檢測1個成分的含量。從本實驗看，GC-MS的峰面積值似可以與LC-MS進行大體含量推導。這為初步判斷GC-MS峰面積值提供了一個便捷方法，值得進一步積累數據，找出規律。