云南蒙自甜石榴皮多酚提取工藝及多酚含片配方優(yōu)化

李建飛 李明明 招艷懷 何斗車(chē) 黃業(yè)偉 朱強(qiáng)強(qiáng)

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)/普洱茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院 云南昆明 650201）

石榴（Punica granatumL.），又名安石榴、若榴，為石榴科石榴屬灌木或喬木，被子植物，主要分布在亞熱帶及溫帶地區(qū)，在我國(guó)多地均有種植，屬漿果類(lèi)水果，營(yíng)養(yǎng)豐富[1-2]。石榴果皮中含有大量的多酚[3]，包括鞣花酸、沒(méi)食子酸、兒茶素、兒茶酚、綠原酸等[4-5]，有抗菌[6-7]、抗癌、緩解人體氧化和衰老、增加皮膚滋潤(rùn)度、抑制血壓升高、促進(jìn)傷口愈合、治療腹瀉[8]、促進(jìn)消化吸收[9]、治療和緩解口腔潰瘍[10-11]等功效。王彩云等[12]研究表明，長(zhǎng)期大量飲用石榴汁（含有豐富的多酚）不會(huì)產(chǎn)生毒害作用，說(shuō)明食用石榴皮多酚比較安全，可進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)食用產(chǎn)品。

石榴皮多酚提取的工藝方法主要有溶劑提取法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法和超臨界流體萃取法等[13-15]，但是，這些提取方法提取時(shí)間較長(zhǎng)、溶劑使用量大、提取溫度高、設(shè)備要求高等缺點(diǎn)，不利于實(shí)際應(yīng)用。目前研究中，石榴皮多酚短時(shí)高效提取依然是其研究方向，短時(shí)高效提取方法的提取率及最優(yōu)提取工藝依然未能確定，需要進(jìn)一步探究石榴多酚的最佳提取工藝。

云南蒙自是云南省重要的石榴產(chǎn)地，石榴產(chǎn)量高且當(dāng)?shù)厥癞a(chǎn)品主要以鮮食為主，目前鮮果產(chǎn)品面臨種植成本提升和產(chǎn)品價(jià)格不斷下降的影響，農(nóng)民獲得利潤(rùn)逐漸降低。蒙自地區(qū)石榴深加工能力不足，產(chǎn)品與國(guó)內(nèi)其他地區(qū)類(lèi)似，多為粗加工產(chǎn)品，對(duì)石榴及其果皮的深加工程度不高，產(chǎn)品附加值低[16]，亟需創(chuàng)新發(fā)展多種形式新產(chǎn)品、新用途。本研究在多酚粗提取及下游產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上進(jìn)行研究，提出石榴皮副產(chǎn)品使用新方向，有助于延長(zhǎng)石榴產(chǎn)業(yè)鏈，把蒙自石榴資源優(yōu)勢(shì)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)業(yè)優(yōu)勢(shì)，持續(xù)為云南鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略發(fā)揮作用。

本研究通過(guò)優(yōu)化石榴果皮的多酚提取工藝及石榴多酚的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)，獲得一種多酚提取工藝及產(chǎn)品優(yōu)化配方，可為云南石榴產(chǎn)業(yè)的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材云南蒙自甜石榴購(gòu)自云南蒙自，為市售。

1.1.2 儀器與設(shè)備DHG-2150B 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（鄭州生元儀器有限公司）；YB-150 粉碎機(jī)（永康市速鋒工貿(mào)有限公司）；AX223ZH/E 電子天平（奧州斯儀器（常州）有限公司）；KQ3200E超聲清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司）；SF-TDL-4A 離心沉淀器（上海菲洽爾分析儀器有限公司）；UV-1800PC 分光光度計(jì)（上海菁華儀器有限公司）；TDP-1.5T 型單沖壓片機(jī)（廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司）。

1.1.3 試劑石榴多酚（食品級(jí)，陜西森悅生物科技有限公司）；淀粉（食品級(jí)，云南云鐘工貿(mào)有限公司）；白砂糖（食品級(jí)，云南滇王驛農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)有限公司）；VC（食品級(jí)，華中藥業(yè)股份有限公司）；麥芽糊精、硬脂酸鎂、三氯蔗糖（食品級(jí)，河南萬(wàn)邦化工科技有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，重慶萬(wàn)盛川東化工集團(tuán)有限公司）、沒(méi)食子酸（分析純，純度>98%，天津市鼎盛鑫化工有限公司）、福林酚試劑（分析純，南京奧多福尼生物科技有限公司）、10%無(wú)水碳酸鈉（分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 石榴預(yù)處理蒙自甜石榴人工去皮，清洗果皮后放至70℃烘箱中干燥7 h，粉碎后，將粉末密封于包裝袋中保存，置于干燥、避光的環(huán)境中，備用。

1.2.2 技術(shù)路線(xiàn)石榴皮干燥后再進(jìn)行提取有助于提高提取率，超聲助溶可減少提取時(shí)間[15，17-18]，石榴皮多酚提取工藝如圖1 所示。

1.2.3 含片制作工藝流程含片的制作工藝成熟，配制合適的配方后即可壓片成型[19-20]，本研究構(gòu)建的含片工藝流程見(jiàn)圖2，用于含片制作和后續(xù)感官評(píng)價(jià)。

1.2.4 總多酚提取、測(cè)定、計(jì)算稱(chēng)取2 g 石榴皮粉，按照料液比加入乙醇溶液，混合后使用100 W的超聲波進(jìn)行超聲助溶10 min，4 000 r/min 離心20 min 后收集上清液，過(guò)濾定容[20-22]，選擇福林酚比色法來(lái)對(duì)石榴皮總多酚進(jìn)行測(cè)定[16-18]。吸取1 mL 石榴皮多酚提取液，超純水稀釋20 倍于容量瓶中，后吸取1 mL 的福林酚試劑，0.5 min 之內(nèi)快速加入3 mL 10%無(wú)水碳酸鈉溶液，搖晃混合、定容。室溫避光反應(yīng)30 min，以0.008、0.016、0.024、0.032、0.040 mg/mL 沒(méi)食子酸的標(biāo)準(zhǔn)溶液為對(duì)照，672 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，回歸方程Y=19.225X–0.0408，相關(guān)系數(shù)r2=0.999 8，在此基礎(chǔ)上根據(jù)公式（1）計(jì)算多酚提取量[23]。

式中，P為多酚提取含量（mg/g）；N為提取液稀釋倍數(shù)；A為吸光值；V為加入的提取液的體積（mL）；M為石榴皮粉的質(zhì)量（g）。

1.2.5 石榴多酚含片輔料處理、篩選、壓片三氯蔗糖、白砂糖作為甜味劑，麥芽糊精作為粘合劑，硬脂酸鎂作為賦形劑，用VC 豐富含片的口感。選用具有疏水性的淀粉增加光滑性。依照國(guó)家添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[23]限量添加。白砂糖充分研磨為粉末，輔料充分混合，及時(shí)壓片。

1.2.6 提取工藝及含片配方參數(shù)優(yōu)化在提取工藝研究中，以多酚提取量為響應(yīng)值，選擇乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間及提取溫度4 個(gè)變量進(jìn)行單因素試驗(yàn)[24-26]，選擇4 因素3 水平正交試驗(yàn)（表1），進(jìn)行最優(yōu)配比的探索。

表1 多酚提取正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)表

（1）乙醇濃度 稱(chēng)取5 份2 g 石榴皮粉末于離心管中，分別加入70%、60%、50%、40%、30%乙醇溶液，按料液比1∶5（g/mL）混合。40℃、100 W 超聲助溶10 min，4 000 r/min 離心20 min，收集上清液并過(guò)濾，根據(jù)1.2.4 計(jì)算總多酚的含量。

（2）料液比 稱(chēng)取5 份2 g 的石榴皮粉于離心管中，加入50%的乙醇溶液溶解，料液比按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）添加。40℃、100 W 超聲助溶10 min，4 000 r/min 離心20 min，收集上清液并過(guò)濾。根據(jù)總多酚的含量測(cè)定方法，根據(jù)1.2.4 計(jì)算總多酚的含量。

（3）提取時(shí)間 稱(chēng)取5 份2 g 的石榴皮粉于離心管中，加入50%的乙醇溶液按1∶5（g/mL）的料液比溶解，超聲助溶時(shí)間梯度為10、20、30、40、50 min，40℃、100 W 超聲，4 000 r/min 離心20 min，收集上清液并過(guò)濾。根據(jù)總多酚的含量測(cè)定方法，于672 nm 下測(cè)吸光度值。

（4）提取溫度 稱(chēng)取5 份2 g 的石榴皮粉于離心管中，加入50%的乙醇溶液按1∶5（g/mL）的料液比溶解，提取溫度梯度為20、30、40、50、60℃，100 W 超聲助溶10 min，4 000 r/min 離心20 min，收集上清液并過(guò)濾。根據(jù)總多酚的含量測(cè)定方法，根據(jù)1.2.4 計(jì)算總多酚的含量。

（5）石榴多酚 石榴多酚添加量分別為1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 g，添加VC 0.2 g，淀粉5.1 g，白砂糖3.5 g，麥芽糊精1.5 g，三氯蔗糖0.007 g，硬脂酸鎂0.1 g，混勻壓片，感官評(píng)定。

（6）淀粉 淀粉添加量分別為5.0、5.1、5.2、5.3、5.4 g，添加石榴多酚1.5 g，VC 0.2 g，白砂糖3.5 g，麥芽糊精1.5 g，三氯蔗糖添加0.007 g，硬脂酸鎂添加0.1 g，混勻壓片，感官評(píng)定。

（7）白砂糖 分別添加白砂糖3.3、3.4、3.5、3.6，3.7 g，添加固定石榴多酚1.5 g，VC 0.2 g，淀粉5.1 g，麥芽糊精1.5 g，三氯蔗糖0.007 g，硬脂酸鎂0.1 g，混勻壓片，感官評(píng)定。

（8）含片配方優(yōu)化在含片制作配方優(yōu)化中，選擇石榴多酚添加量、淀粉添加量、白砂糖添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)[26-28]，通過(guò)感官評(píng)定[29]（表2），選擇3 因素3 水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表3）。

表2 石榴多酚含片感官評(píng)定指標(biāo)

表3 石榴多酚含片配方正交試驗(yàn)因素水平表

1.2.7 含片質(zhì)量要求隨機(jī)抽取10 片含片，稱(chēng)重。根據(jù)《中國(guó)藥典》[30]中含片要求，重量差異限度1 倍范圍為合格品，其他為次品。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理所有試驗(yàn)平行測(cè)定3 次，單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果用Graph Pad 5 作圖，用SPSS 22 軟件進(jìn)行正交分析，以p<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素對(duì)石榴皮多酚提取量的影響

石榴皮多酚提取量隨著乙醇濃度升高逐漸升高，并在60%時(shí)多酚提取量較高（8.53 mg/g），且與其他組顯著差異（p<0.05）；隨后乙醇濃度的繼續(xù)升高，多酚含量下降（圖1-A），這可能是提取溶劑乙醇與石榴皮多酚之間的極性差異增大，致使提取率降低引起的[13]；70%時(shí)多酚提取降到5.86 mg/g。綜上，選用50%、60%、70%的乙醇濃度進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

料液比在1∶10（g/mL）條件下，獲得最大多酚提取量8.248 mg/g，與其他組相比具有顯著差異性（p<0.05，圖1-B）。料液比的提高有助于增加石榴皮粉末與溶液之間的接觸面積，增加提取量[31]，但料液比達(dá)到一定比例后，多酚在溶液中的擴(kuò)散達(dá)到最大值，增加溶液體積不會(huì)進(jìn)一步增加提取量，甚至?xí)♂尪喾拥奶崛舛萚31-32]，降低提取量。本研究也發(fā)現(xiàn)，較高的料液比會(huì)降低多酚提取量，因此，選用料液比1∶5、1∶10、1∶15（g/mL）進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

提取時(shí)間在30 min 時(shí)，獲得較高的多酚提取量，達(dá)到5.45 mg/g（圖1-C），與其他時(shí)間點(diǎn)相比具有顯著性差異（p<0.05）。但是隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多酚提取量會(huì)下降，這是由于長(zhǎng)時(shí)間提取會(huì)導(dǎo)致多酚發(fā)生氧化、聚合等反應(yīng)會(huì)破壞總多酚物質(zhì)結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取量減少[33]。因此，選用提取時(shí)間20、30、40 min 進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

隨著溫度的提高，石榴多酚的提取量逐漸增高，在30℃時(shí)達(dá)到相對(duì)高點(diǎn)，含量為6.92 mg/g（圖1-D）；隨著溫度升高，多酚含量維持較高的水平，40 和50℃提取量均值分別為6.77 和6.75 mg/g，與30℃提取相比無(wú)顯著差異(p>0.05)，但是與20℃相比均具有顯著差異性(p<0.05)。較高溫度會(huì)導(dǎo)致多酚結(jié)果破壞[34]，減少多酚提取量。本研究也發(fā)現(xiàn)，60℃時(shí)多酚提取量顯著下降，因此結(jié)合提取率的差異性，選用提取溫度30、40、50℃進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.2 石榴皮多酚提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化

由表4 中極差R值可知，4 個(gè)因素對(duì)多酚提取量的影響排序是D>A>B>C；正交試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)組合為A2B3C1D2，石榴皮總多酚提取量為8.331 mg/g；通過(guò)優(yōu)化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按A2B2C1D2的提取工藝與試驗(yàn)最優(yōu)組（6 號(hào)，A2B3C1D2）進(jìn)行驗(yàn)證對(duì)比，A2B2C1D2提取工藝的總多酚提取量為8.59 mg/g，優(yōu)于6 號(hào)組合。根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，確定石榴皮多酚的提取優(yōu)化工藝為提取溫度30℃、提取時(shí)間30 min、料液比1∶10（g/mL）、乙醇濃度 60%，所得的石榴皮總多酚含量為8.59 mg/g。

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.3 單因素對(duì)石榴多酚含片工藝的影響

多酚含量對(duì)感官評(píng)分具有顯著影響，過(guò)低會(huì)造成無(wú)多酚口感，評(píng)分較低（<60）；過(guò)高又會(huì)苦味濃，評(píng)分低于70；當(dāng)石榴多酚添加量為1.4 g有較好的口感，感官評(píng)分與其他各組相比具有顯著性差異（p<0.05），故選用多酚添加量1.3、1.4、1.5 g 進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

淀粉量添加對(duì)含片的口感影響較大，隨著淀粉添加量的增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先高后低的現(xiàn)象，且在淀粉添加量為5.1 g 時(shí)，感官評(píng)分最高，均值在78 分，與其他組別有顯著性差異(p<0.05)，故選用淀粉添加量5.0、5.1、5.2 g 進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

隨著白砂糖添加量增加，感官評(píng)分呈現(xiàn)先升高后降低，添加較少口味偏苦，評(píng)分均值在70；添加過(guò)多會(huì)造成甜度過(guò)高，遮蓋多酚味道，評(píng)分也較低（<70）；當(dāng)白砂糖添加量為3.5 g 時(shí)，獲得較高的感官評(píng)分（均值82），與其他組有顯著性差異(p<0.05)，故選用白砂糖添加量3.4、3.5、3.6 g 進(jìn)行進(jìn)一步的正交試驗(yàn)優(yōu)化。

2.4 含片配方最佳工藝的確定

通過(guò)正交試驗(yàn)極差分析（表5）可知，石榴多酚添加量、淀粉添加量、白砂糖添加量這3 個(gè)因素對(duì)含片質(zhì)量影響力順序?yàn)椋篶>a>b。正交試驗(yàn)感官評(píng)分顯示，a2b3c1組合具有較高的感官評(píng)分，均值達(dá)到89.11，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果分析，獲得多酚含片最優(yōu)工藝配方為石榴多酚1.4 g、淀粉5.2 g、白砂糖3.4 g，得到的含片片劑完整，表面光滑，口感細(xì)膩，甜味合適，苦味適中，且有回甘。

表5 石榴多酚含片配方感官評(píng)定表

2.5 含片質(zhì)控

隨機(jī)從最優(yōu)配方制作的含片中抽取10 片，稱(chēng)出重量，總重為3.396 g，平均片重為0.340 g。根據(jù)《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定，重量差異限度1 倍范圍得到0.289<0.340<0.390 g，說(shuō)明含片大小基本一致，片劑之間重量差異較小，為合格品。

3 討論與結(jié)論

本研究充分利用云南特色水果資源——蒙自石榴，采用廢棄石榴皮作為原料，通過(guò)探究石榴皮中提取多酚的工藝并進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了一種較優(yōu)的石榴皮多酚提取工藝，所得的石榴皮總多酚含量為8.591 mg/g。在此基礎(chǔ)上，本研究?jī)?yōu)化了石榴多酚含片的配方，得到一種甜味、苦味適中的含片配方。

石榴皮中多酚的提取可減少資源浪費(fèi)，促進(jìn)石榴綜合利用。本研究從料液比、溫度、乙醇濃度、提取時(shí)間4 個(gè)因素入手，探索影響石榴皮多酚提取的4 個(gè)因素，確定了一種較優(yōu)的提取工藝，這些提取因素與其他研究報(bào)道相似，說(shuō)明本研究在影響多酚提取的因素選擇上具有代表性。穆談航等[28]的研究結(jié)果與本研究相似，料液比一致，獲得的多酚提取量相近，但是其提取時(shí)間為40 min，較本研提取時(shí)間30 min 更長(zhǎng)。吳琳等[13]的研究與本研究相比，其提取率未有較大提高，但是其提取過(guò)程使用的料液比較大，提取溫度（50℃）更高和時(shí)間（2 h）更長(zhǎng)，相比之下，本文進(jìn)行的提取研究經(jīng)濟(jì)性更好。

石榴多酚的綜合利用是提高其附加值的重要手段，石榴多酚乳膏、抗老化和衰老類(lèi)化妝品等產(chǎn)品已經(jīng)被研發(fā)或進(jìn)入市場(chǎng)銷(xiāo)售。本研究從食品角度入手，開(kāi)發(fā)了一種含石榴多酚的含片產(chǎn)品，與化妝品類(lèi)產(chǎn)品相比，生產(chǎn)成本低廉，更容易進(jìn)入大眾消費(fèi)市場(chǎng)。相關(guān)報(bào)道[35]稱(chēng)，多酚可以增加腸道菌群的均勻性和豐富度，調(diào)節(jié)菌群結(jié)構(gòu)，提高益生菌相對(duì)豐度。可以預(yù)見(jiàn)，食用石榴多酚含片類(lèi)產(chǎn)品在調(diào)節(jié)腸道微生物菌群變化方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。