Lupalbigenin 抑制Ba/F3 EGFR WT 野生型肺癌細胞增殖作用機制

楊星瑩 朱威巍 江麗 爨向丹 盛軍 黃艷蘋1,

（1.云南農業大學/普洱茶學教育部重點實驗室 云南昆明 650201；2.云南農業大學食品科學技術學院 云南昆明 650201；3.云南農業大學理學院 云南昆明 650201；4.云南省高原特色農業產業研究院 云南昆明 650201）

肺癌是目前惡性腫瘤死亡的首要原因[1]，在腫瘤治療中備受關注。肺癌又被分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）約占肺癌總數的85%以上[2]。非小細胞肺癌分為肺腺癌、鱗狀細胞癌（SCC）和大細胞肺癌（LCC）的組織學亞型，以上病癥每年造成150 多萬人死亡[3-4]。表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）屬于人表皮受體酪氨酸激酶家族的一員，該家族還包括人表皮生長因子受體 2、3、4[HER2/neu（ERBB2），HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）]3 個成員[5-6]。EGFR 參與調節多種細胞生命過程，如增殖、分化、存活等[7]。EGFR主要包括4 個部分：胞外配體結合域、跨膜域、酪氨酸激酶域和C 端尾[8]。當EGFR 與配體（EGF）結合后，胞內的酪氨酸激酶域會發生動態構象變化，通過首尾相連的方式形成不對稱二聚體，使胞內C 端酪氨酸激酶殘基發生磷酸化[9]。肺癌患者具有極低的存活率[10]，科學家們在這些患者的肺癌腫瘤中發現EGFR 的表達量明顯高于常人[11]。因此靶向EGFR 治療非小細胞肺癌具有重要意義。

本實驗所用化合物Lupalbigenin（LG）是一種類黃酮天然化合物。已有文獻報道，從Derrisscandens中分離出的LG 可以誘導乳腺癌細胞系發生死亡[12]。Ausawasamrit 等[13]發現，LG可以通過影響蛋白激酶B（AKT）和細胞外調節蛋白激酶（Erk）的磷酸化來誘導肺癌細胞發生凋亡。還有研究報道，LG 通過下調炎癥基因和蛋白表達來抑制NF-κB 信號的傳導[14]。根據前人LG在癌癥和炎癥治療方面的相關研究，本研究對LG抑制EGFR 野生型肺癌細胞增殖作用機制進行研究。構建Ba/F3 EGFR WT 細胞并經過單克隆、流式細胞術、Western blot 檢測EGFR 表達量，通過MTS 法篩選出化合物LG，使用LG 處理細胞，從細胞存活率、細胞形態、細胞凋亡情況、周期阻滯情況、信號通路轉導變化方面闡述LG 抑制Ba/F3 EGFR WT 肺癌細胞增殖作用機制。驗證LG是否能抑制Ba/F3 EGFR WT 細胞增殖，并且在EGF 存在時依舊能抑制細胞存活，以期為治療EGFR 野生型非小細胞肺癌患者提供新的基礎研究理論，同時為天然化合物治療人類疾病提供相關依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用化合物LG，分子式C25H26O5，純度99%，購于云南西力生物技術股份有限公司，其結構式如圖1 所示。實驗用細胞Ba/F3 購于美國典型培養物保藏中心（Manassas，VA，USA），并在含有10% FBS、1% P/S 和5%白介素3（IL3）的1640 培養基中于37℃下在含5% CO2的細胞培養箱中進行培養（BINDER；Tuttlingen，Ger-many）。實驗用抗體購于Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計將EGFR WT 質粒轉化入大腸桿菌中擴大培養，使用無內毒素大提質粒試劑盒提取質粒測定濃度后，使用電轉染將質粒導入Ba/F3 細胞。經過轉化實驗、抗生素篩選、單克隆實驗得到高表達EGFR 的Ba/F3 EGFR WT 野生型肺癌細胞。使用MTS 法篩選化合物LG，再確定有效濃度，選取2 個有效濃度分別聯合EGF 處理Ba/F3 EGFR WT 細胞。試驗設6 個處理組：對照組，Control；EGF 組：EGF；5 μmol/L 的LG組，LG 5 μmol/L；5 μmol/L 的LG 聯合應用EGF組，LG 5 μmol/L+EGF；10 μmol/L 的LG 組，LG 10 μmol/L；10 μmol/L 的LG 聯合應用EGF 組，LG 10 μmol/L+EGF。依次檢測6 個處理組細胞存活率、細胞狀態、EGFR 信號轉導變化、凋亡水平和周期阻滯情況。

1.2.2 細胞培養與傳代當細胞單層布滿細胞培養瓶時，在超凈工作臺中，用移液器吹勻細胞后取出轉移至離心管中1 000 r/min 離心3 min，棄上清。加入無菌、預熱的PBS 吹勻洗滌，1 000 r/min 離心3 min，棄上清后加入完全培養基輕吹混勻細胞，分別移入兩個T25 細胞培養瓶中，補充適量相應的完全培養基觀察狀態后置于37℃恒溫培養箱中培養。

1.2.3 質粒提取將質粒轉化入大腸桿菌；添加適量抗生素培養篩選并擴大培養目的菌種，收集離心后，使用無內毒素質粒大提試劑盒提取目的質粒，使用分光光度計測定質粒濃度，保存質粒備用。

1.2.4 細胞轉染收集狀態良好的Ba/F3 細胞，經過計數計算使用轉染試劑盒中的T Buffer 將細胞Ba/F3 密度調整為5×107個/mL，并按照比例與質粒混合，電轉槍取一槍細胞密度為 5×106或2×106個/100 μL。在電轉杯內加入3 mL E Buffer。通過NeonTM電轉染系統選擇合適程序將質粒導入細胞內。轉染完成的細胞用新鮮1640 培養基（含有10% FBS）混勻，細胞培養箱培養24 h 后加入篩選抗生素擴大培養。

1.2.5 細胞篩選細胞轉染24 h 之后，將細胞培養基替換為完全培養基（含有10% FBS，1% P/S）。48 h 后加入嘌呤霉素，正常進行細胞傳代與換液。

1.2.6 細胞單克隆取狀態穩定的轉染細胞離心后，重懸、計數，96 孔板接單克隆，保證每個孔0.5 個細胞。混勻含有細胞的混合液，用排槍將細胞液轉移到96 孔板中，每孔200 μL，周圍用無菌PBS 填充。置于37℃細胞培養箱培養10 d，在顯微鏡下逐孔觀察，將單一細胞團轉移到小皿中，根據細胞生長狀態及密度逐步擴大培養。

1.2.7 MTS 檢測細胞增殖將細胞密度調整為每100 μL 5×104個細胞，用無酚紅1 640 培養基混勻，接種于96 孔板中，恒溫培養箱靜置4 h；再加入含有藥物的培養基 100 μL/孔，總體積200 μL/孔，置于37℃培養箱處理48 h；加入MTS溶液，20 μL/孔，避光孵育3～4 h，震蕩5～10 min充分溶解結晶物。將96 孔板放于酶標儀中，在492 nm 處讀取細胞的吸光值。

1.2.8 細胞蛋白表達檢測

（1）細胞蛋白提取 取經過藥物處理的細胞1 000 r/min，離心3 min，棄上清；冰PBS 清洗一遍離心后棄上清，加入高效裂解液（PMSF:RIPA高效裂解液=1∶100），冰上裂解30 min，放入4℃離心機，15 000 g，離心20 min，吸出上清，放于冰上備用。

（2）蛋白濃度測定 37℃恒溫孵育30 min，使用多通道酶標儀測定吸光度，測定波長分別為560 和630 nm，測定數值均扣除空白孔吸光值，代入計算公式得到樣品蛋白濃度。

（3）蛋白電泳與轉膜 將蛋白樣品按順序依次加入凝膠泳道，電泳第一階段電壓為50 V，待蛋白跑出濃縮膠后增加電壓至120 V，根據目的蛋白分子量調節第二階段時間。將分離膠與甲醇激活的PVDF 膜帖在一起，放入轉膜夾中卡入轉膜槽，設置電流為200 mA，轉膜時間為60 min。

（4）化學發光 配制化學發光液（A∶B=1∶1），混勻，將膜與發光液充分接觸，點擊“Expose”開始曝光。曝光時間根據出現條帶的曝光程度自動選擇曝光停止時間，曝光停止后選擇合適的圖片拷貝。

1.2.9 數據分析與統計采用SPSS 17.0 軟件進行顯著性分析[（mean+SEM），one-way ANOVA]，*p<0.05 為差異顯著，**p<0.01 為差異有明顯顯著，***p<0.001 為差異極顯著。使用GraphPad Prism8 作圖軟件，對實驗數據進行作圖。細胞存活率=[（As–Ab）]/[(Ac–Ab)]×100%，As：驗孔吸光度；Ac：對照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。細胞抑制率=1–細胞存活率。

2 結果與分析

2.1 穩定表達EGFR 細胞株構建

通過電穿孔轉染法成功構建 Ba/F3 EGFR WT 細胞，該細胞可脫離IL3 獨立生長。通過流式細胞技術對單克隆細胞EGFR 表達水平進行檢測，如圖2-a 所示，EGFR 表達量為98.04%。同時利用Western blot 檢測Ba/F3 細胞和Ba/F3 EGFR WT 細胞的EGFR 蛋白表達水平。結果如圖2-b 所示，Ba/F3 EGFR WT 細胞高表達EGFR蛋白，因此細胞系構建成功，可以進行后續實驗。

2.2 MTS 法篩選化合物并確定有效濃度

基于云南農業大學普洱茶教育部重點實驗室化合物庫中的天然化合物選擇5 種化合物見表1，濃度5 μmol/L，在Ba/F3 EGFR WT 細胞上使用MTS 法進行篩選。其中Lupalbigenin（LG）能夠抑制Ba/F3 EGFR WT 細胞增殖，如圖3-a 所示，LG 將Ba/F3 EGFR WT 細胞存活降低至50%以下，如圖3-b 所示，并且隨著LG 濃度的升高細胞存活逐漸降低。

表1 化合物信息

2.3 LG 改變Ba/F3 EGFR WT 細胞形態

LG 處理Ba/F3 EGFR WT 細胞15 h 后其細胞形態如圖4 所示。可以看出，Ba/F3 EGFR WT 細胞形態發生明顯變化。對照組的Ba/F3 EGFR WT細胞形態圓潤透亮有光澤，在培養液中下層且生長密集。處理組（LG 10 μmol/L+EGF）細胞狀態明顯改變，體積明顯縮小、細胞膜破裂呈碎片、呈不透亮的狀態。

2.4 LG 對Ba/F3 EGFR WT 細胞EGFR 信號通路的影響

經過1 h 的處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組顯著抑制Ba/F3 EGFR WT 細胞EGFR 相關蛋白磷酸化表達，降低了P-EGFR、P-Erk、P-Gsk-3β和P-S6蛋白表達水平（圖5）。表明10 μmol/L 的LG 可以抑制EGFR 下游信號通路轉導，并且在EGF 存在時也有抑制效果。

2.5 LG對Ba/F3 EGFR WT細胞凋亡率的影響

經過15 h 的處理后，EGF 組凋亡率低于對照（Control），LG 10 μmol/L 凋亡率最高。LG 10 μmol/L+EGF 組凋亡率有所回升，但也高于對照組（Control）、EGF 組和兩個低濃度組（LG 5 μmol/L 和LG 5 μmol/L+EGF）（圖6）。表明10 μmol/L 的LG 可以增加Ba/F3 EGFR WT 細胞凋亡率。

2.6 LG 對Ba/F3 E GFR WT 細胞凋亡相關蛋白表達水平的影響

經過15 h 處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組與其他組相比，可以上調Bax 和下調Bcl-2 蛋白的表達，誘導Cytochrome-C 釋放，激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，使得Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-6、Cleaved-Caspase-7 的表達上調（圖7）。這表明LG 通過激活Bcl-2 家族、釋放 Cytochrome-C 來激活 Caspase 家族，通過Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 執行Ba/F3 EGFR WT 細胞凋亡，且在EGF 存在時細胞凋亡蛋白表達增加。

2.7 LG 對Ba/F3 E GFR WT 細胞周期相關蛋白表達水平的影響

經過15 h 處理后，LG 10 μmol/L+EGF 組與其他組相比，上調細胞內P27 蛋白表達（圖8），阻抑細胞周期由G1/S 期向下一時期轉移，從而抑制CDK6 蛋白的表達，進而抑制Cyclin D1 的表達，將Ba/F3 EGFR WT 細胞的周期阻滯在G1/S期，同時對 Cyclin A2 的表達也有抑制作用，Cyclin A2 蛋白的調控周期是S 期。表明LG 能夠將Ba/F3 EGFR WT 細胞的周期阻滯在G1/S 期，且在EGF 存在時對細胞周期相關蛋白阻滯效果更加明顯。

3 討論與結論

3.1 討論

本實驗用的轉染方法是電穿孔轉染法[15]，使用NeonTM電轉染系統。利用Ba/F3 細胞自身不表達EGFR、依賴于白介素3（IL3）且生長迅速易于轉染等特點，以Ba/F3 為模式細胞使用電轉染的方法將EGFR WT 質粒導入Ba/F3 細胞，構建了Ba/F3 EGFR WT 細胞。根據普洱茶學教育部重點實驗室前期的實驗基礎，EGFR WT 轉染條件為1 400 V，20 ms，2 pulse。已有文獻報道，用Ba/F3 細胞進行轉染構建穩定表達EGFR 的Ba/F3 細胞[16]。Xie 等[17]通過使用IL3 剝奪法成功構建表達 EGFR-insH 突變的 Ba/F3 細胞系（Ba/F3-insH 細胞系）。Yuza 等[18]通過抗生素篩選和IL3 獨立篩選構建了表達3 個EGFR 20 號外顯子突變的Ba/F3 細胞。為了獲得單一來源且穩定表達EGFR 的細胞株，在培養基中添加篩選抗生素對Ba/F3 EGFR WT 細胞進行單克隆培養。證明Ba/F3 EGFR WT 細胞能夠脫離IL3 獨立生長，且通過流式細胞術和Western blot 實驗證明是高表達EGFR 的野生型肺癌細胞。因此本實驗采用的細胞系構建方法是成功的，可以為質粒轉染和細胞系構建提供新的方法和思路。

已有研究表明，EGFR 信號的異?；罨捌鋵е碌南掠涡盘柤せ钆c癌癥的驅動因素（標志特征）密切相關[19]，使用靶向藥物特異性地封閉EGFR 信號，將對癌癥的治療產生重要影響。目前關于EGFR 的靶向藥物主要包括單抗類藥物和小分子酪氨酸激酶抑制劑[20]。2004 年6 月，美國科學家Lynch 等[21]和Paez 等[22]發現，具有EGFR突變的肺癌患者使用靶向藥物治療可以有更好的治療效果。研究結果顯示，吉非替尼（Gefitinib）在治療具有EGFR 突變的腫瘤患者有效率高達80%以上，而這種藥物在治療無突變的野生型（Wild-Type）腫瘤患者基本無效[23]，隨后這一觀點，在一年內相繼被Mu 等[24]、Mitsudomi 等[25]、Han 等[26]和Huang 等[27]各國科學家證實。因此為野生型EGFR 肺癌患者尋找新的治療方案和藥物成為科學家研究的難題。

由于癌癥機制復雜性，不同藥物的敏感性和耐藥性、缺乏標志物以及藥物監管測試都給靶向藥物的上市帶來巨大挑戰[28]。不乏患者在接受靶向藥物治療時產生許多副作用，如皮疹、腹瀉和血壓等問題[29]，因此人們將目光轉向來源廣泛、毒副作用小的天然化合物。天然化合物種類繁多，許多天然化合物的抗癌潛力已被開發[30]。90 年代中期，有2 種喜樹堿類拓撲替康和伊立替康[31-32]獲得FDA 批準用于治療各種類型的癌癥。2005年紫杉醇獲批用于治療轉移性乳腺癌、胰腺癌和非小細胞肺癌[33]。目前大部分抗癌藥物是天然產物來源[34]，已有文獻報道，天然化合物LG 能夠誘導人大細胞肺癌細胞死亡[13]，但并未明確靶點。對于非小細胞肺癌，LG 可以抑制EGFR 相關蛋白磷酸化，因此以EGFR 為作用靶點進行一系列驗證。由于此實驗未開展動物實驗，LG 在體內表現還不明確，其與EGFR 具體結合位點還有待進一步確認。

3.2 結論

經實驗結果證明，LG 在調控EGFR 野生型肺癌細胞增殖方面起到重要作用，其機制主要是通過抑制Ba/F3 EGFR WT 細胞EGFR 及下游相關蛋白磷酸化水平表達，進而靶向細胞凋亡、細胞周期，從而通過誘導細胞凋亡來抑制野生型EGFR肺癌細胞Ba/F3 EGFR WT 的存活。本研究有望為調控野生型EGFR 肺癌腫瘤提供藥物開發的新思路。