基于PI3K/AKT 信號通路探討表兒茶素對口腔癌細胞的作用

謝明杰，陳穗保

（廣東省第二人民醫院口腔科，廣東 廣州 510317）

口腔癌（oral cancer）是一種世界范圍內的高發病率癌癥，死亡率較高[1-3]。隨著咀嚼檳榔、飲酒和吸煙的人群逐漸增多，口腔癌在多個國家的發病率和死亡率逐年增加[4，5]。因此，通過開發更有效的治療方法來治愈口腔癌至關重要。抗癌藥物與放療聯合是治療口腔癌的常見策略[6，7]。然而，這種聯合治療通常會對正常組織產生嚴重的副作用，患者依從性和預后較差。表兒茶素（Epicatechin）作為茶多酚中主要的活性單體，藥理作用廣泛，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、預防心血管疾病、改善糖尿病和免疫調節等作用[8-10]。研究表明[11]，PI3K/AKT 信號通路對口腔癌細胞增殖、侵襲、抑制凋亡和血管生成均起著重要作用。本研究旨在通過PI3K/AKT 信號通路探討表兒茶素對口腔癌細胞的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物與試劑 表兒茶素，純度＞98%，批號：SE8100，購于上海脈鉑醫藥科技有限公司；TNF-α和IL-1β ELISA 試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司；人口腔癌KB 細胞購于中科院上海細胞庫；CCK-8 購于上海碧云天生物技術公司；RPMI-1640 細胞培養液、胎牛血清（FBS）購于美國gibco公司；PI3K 和AKT 單抗和GAPDH 二抗購于英國Abcam 公司。

1.2 主要儀器 DYCZ-24DN 迷你雙垂直電泳儀電泳槽蛋白凝膠電泳儀、WD-9413A 凝膠成像分析系統和WD-9402D 型梯度PCR 儀購于北京六一儀器廠；二氧化碳培養箱購于Thermo Fisher Scientific 公司；SKSW-KC-100 型酶標儀購于北京海富達科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 37 ℃孵育復蘇人口腔癌KB 細胞后，使用1%雙抗RMPI-1640 培養液（含10%FBS），于5% CO2和37 ℃細胞培養箱中常規傳代培養細胞。

1.3.2 細胞增殖抑制率（CCK-8 法）選擇對數生長期的人口腔癌KB 細胞，采用0.25%胰酶-EDTA 消化貼壁細胞，新鮮完全培養基終止反應、1000 rpm離心5 min，稀釋為1×104個細胞，100 μl/孔接種于96 孔板，細胞培養箱靜置培養24 h，分別加入濃度為20、40、80、160 nmol/L 的表兒茶素處理，0 nmol/L 為空白對照組，每組設定6 個復孔。放回細胞培養箱分別再培養24、48、72 h 后，每孔加入10 μl的CCK8 試劑并放回細胞培養箱中孵育3 h，在450 nm 波長處檢測各孔OD 值，分析各組細胞的增殖抑制率。其中，增殖抑制率（%）=[1－OD（λ）藥物處理組/OD（λ）空白對照組]×100%

1.3.3 細胞TNF-α 和IL-1β 水平（ELISA 法）取對數生長期的人口腔癌KB 細胞，稀釋成1×105個后，1 ml/孔接種于24 孔培養板中，繼續在細胞培養箱中培養24 h，分別加入表兒茶素處理，其終濃度分別為20、40、80、160 nmol/L，0 nmol/L 為空白對照組，每組設定6 個重復孔，繼續培養細胞48 h，收集細胞上清，按試劑盒說明書操作步驟，檢測細胞上清TNF-α 和IL-1β 水平。

1.3.4 細胞Bax 和Bcl-2 基因表達水平（RT-PCR法）按1.3.3 方法處理細胞后，PBS 緩沖液沖洗細胞3 次，提取細胞總RNA，使用PCR 儀檢測Bax 和Bcl-2 基因的表達水平。Bax 和Bcl-2 的引物序列見表1。

表1 Bax 和Bcl-2 的引物序列

1.3.5 細胞PI3K 和AKT 蛋白表達水平（Western blot法）按1.3.3 方法處理細胞后，裂解細胞和檢測細胞蛋白。配制電泳凝膠（12%分離膠和5%濃縮膠），每孔30 μg/孔上樣，SDS-PAGE 電泳分離（120 V）、轉膜（80 V）、5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入PI3K（1∶1000）和AKT（1∶1000）一抗4 ℃冰箱孵育過夜。洗膜5 次后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗膜5 次，專用儀器自動曝光。分析圖像的灰度值（Image J 軟件）。目的蛋白表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH 條帶灰度值。

1.4 統計學方法 應用SPSS 19.0 統計軟件分析實驗數據，計量資料以（）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t法，以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組增殖抑制率比較 表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞的增殖抑制率的影響

2.2 各組TNF-α 和IL-1β 水平比較 表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞TNF-α 和IL-1β 水平的影響

2.3 各組Bcl-2 和Bax mRNA 表達比較 表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達量低于空白對照組，而Bax mRNA 表達量高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達量低于20 nmol/L 表兒茶素組，而Bax mRNA 表達量高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

圖3 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞Bcl-2 和Bax mRNA 表達的影響

2.4 各組PI3K 和AKT 蛋白表達比較 表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 表兒茶素對人口腔癌KB 細胞PI3K 和AKT 蛋白表達的影響

3 討論

口腔癌是世界上最常見癌癥之一，其5 年生存率較低，不超過50%[12]。口腔癌的治療包括手術、放療、化療和靶向治療等。最常用的化療藥物有5-氟尿嘧啶、卡鉑、順鉑和紫杉醇[13]。然而，耐藥性和副作用大仍然是化療的重要障礙。因此，開發更有效以及更安全的抗口腔癌藥物極為重要。

腫瘤細胞一般呈現出增殖和分化異常的基本特征，如控制腫瘤細胞增殖和分化可作為初步判斷藥物有效性的依據之一[14]。本研究結果顯示，表兒茶素處理組24、48、72 h 增殖抑制率高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組24、48、72 h 增殖抑制率均高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示表兒茶素可明顯抑制人口腔癌KB細胞的增殖，呈濃度和時間依賴性。多種炎癥因子與癌癥的發生發展密切相關。有研究顯示[15，16]，高水平的TNF-α 可明顯促進腫瘤惡化，而IL-1β 參與了腫瘤的發生與轉移。本研究結果顯示，表兒茶素處理組TNF-α 和IL-1β 水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組TNF-α 和IL-1β 水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明表兒茶素可降低人口腔癌KB 細胞TNF-α 和IL-1β 的水平，提示表兒茶素可能通過抑制炎癥，進而抑制口腔癌細胞的過度增殖。此外，促進異常細胞的凋亡也是抗癌的重要策略，而線粒體凋亡途徑是細胞重要的凋亡途徑，Bcl-2 和Bax 是線粒體凋亡途徑中重要的調控因子[17]。本研究結果表明，表兒茶素處理組Bcl-2 mRNA 表達量低于空白對照組，而Bax mRNA 表達量高于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組Bcl-2 mRNA 表達量低于20 nmol/L 表兒茶素組，而Bax mRNA 表達量高于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），說明表兒茶素上調人口腔癌KB 細胞Bax mRNA 的表達水平，而下調Bcl-2 mRNA 的表達水平，呈濃度依賴性，提示表兒茶素可能通過影響線粒體凋亡途徑，促進人口腔癌KB 細胞的凋亡。研究顯示[18-20]，PI3K/AKT 信號通路參與調控癌細胞的增殖、分化和侵襲等。本研究結果表明，表兒茶素處理組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于空白對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且80 nmol/L 表兒茶素組和160 nmol/L 表兒茶素組PI3K 和AKT 蛋白表達水平低于20 nmol/L 表兒茶素組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示表兒茶素通過抑制PI3K/AKT 信號通路PI3K 和AKT 蛋白的表達水平，從而抑制人口腔癌KB 細胞的過度增殖。

綜上所述，表兒茶素可抑制人口腔癌KB 細胞的過度增殖，促進其凋亡，其作用機制可能與抑制PI3K/AKT 信號通路有關。