CRISPR/Cas9系統在豬中的應用研究進展

許 棟 ，許園芳 ，謝擁軍 ，馬海明 ，彭濟紅

（1.岳陽職業技術學院生物環境工程學院，湖南 岳陽 414000；2.湖南農業大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；3.臨湘市柳廠梅花鹿養殖專業合作社，湖南 岳陽 414316）

現代畜牧業中，養豬的最終目標之一是提高瘦肉率、降低脂肪含量、提高豬肉品質和口感。豬肉作為大多數中國人餐桌上必不可少的蛋白質來源，對日常生活有著巨大的影響，因此，積極開展豬的遺傳育種改良具有重要意義。我國本地豬種的遺傳資源具有抗病性強、適應性強、性成熟早、遺傳性能穩定等優良特性。隨著時間的推移，研究人員通過將我國本地豬種與國外豬品種雜交等傳統遺傳改良方法，在改善本地豬種產仔數、胴體瘦肉率、生長速度和抗病性等方面取得了顯著成果，但這些研究進展都比較緩慢，往往需要幾十年才能取得有效突破。傳統的基因改良速度慢、成本高、效率低，而新興的基因編輯技術在豬的遺傳改良中具有廣闊的應用前景。自CRISPR/Cas9開始在豬群成功應用以來，在改善豬生長性狀方面取得了多項突破。隨著對動物肌肉生長相關基因如肌生成抑制素（Myostatin，MSTN）的深入研究，解耦聯蛋白1（Uncoupling protein 1，UCP1）和胰島素樣生長因子2基因（Insulin-like growth factor 2 gene，IGF-2）功能的發現，運用基因組編輯技術提供了在短時間內改良本地豬種的研究思路，具有巨大的發展潛力和應用前景。文章簡要描述了CRISPR/Cas9系統的發展過程、在豬生產應用中的研究進展，以及通過CRISPR/Cas9系統對豬基因組引入適當的修飾，并對豬器官被人體利用的可能性進行了概述，同時對CRISPR/Cas9應用前景進行了展望。

1 CRISPR/Cas9系統技術概述

CRISPR/Cas9系統可以在基因組的特定位點引入DNA雙鏈斷裂，通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）或同源重組（Homologous recombination，HR）實現DNA修復。在NHEJ過程中，DNA雙鏈斷裂（DNA double-strand break，DSBs）外可能會出現小片段的插入或缺失，導致移碼突變或過早產生終止密碼子敲除基因。CRISPR/Cas9系統特異性高、操作簡單，被廣泛應用于很多大型動物的基因組編輯中，如豬、牛、綿羊和猴。在CRISPR/Cas9系統被使用以前，克隆綿羊多利的出生使得體細胞核移植（the somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術成了那個時代的熱點，被從事相關領域的專家們選擇用于家畜動物的研究，SCNT技術是基于培養的家畜原代細胞上的研究方法，在體外研究過程中，利用HR技術對供體基因組中的目標基因進行敲除，將目標基因進行重新整合，但通過HR技術正確整合一個目標DNA序列非常不容易，通常只有百萬分之一的細胞會攜帶正確的整合序列，還會導致功能性的基因被意外敲除，這些克隆后的陽性細胞經過長時間的選擇和增殖后，最終會以衰亡的狀態結束。具有正確整合序列的細胞可應用于去核卵母細胞的重建，由此產生的轉基因后代是克隆出來的，所有的遺傳物質與親代細胞完全相同。自20世紀90年代末以來，SCNT技術使家畜的轉基因研究迅速發展，可即便該技術被改良進步了，在實施上仍存在諸多困難，世界上僅有幾個重點實驗室真正掌握了該項技術。使用成年動物的供體細胞克隆出第一個哺乳動物距離現在已經20多年了，但SCNT技術的效率依然非常低，目前只有不到10%的整合細胞成功轉移到受體，并產生了可存活的后代，在對豬的研究中，僅有3%～5%的移植胚胎產生了可存活的后代。因此，盡管SCNT技術能夠產生經基因敲除處理的動物，但這個技術效率仍然不高，價格相對昂貴，且需要大量的專業知識，全球范圍內掌握該技術的實驗室也很少?；诖吮尘埃珻RISPR/Cas9系統的出現給基因研究領域的專家們帶來了新的研究思路和方向。

2 CRISPR/Cas9系統技術在豬中的研究應用

2.1 CRISPR/Cas9系統技術以豬為模型的病理研究

將CRISPR/Cas9系統作為基因組編輯工具，大大提高了基礎生物學中科學模型的研究效率，豬作為生物醫學模型治療人類的疾病已經有了多年的研究歷史，該模型在大小和生理上都與人類非常相似。在豬這種缺乏真實胚胎干細胞系的物種中，這項技術徹底改變了創建DNA編輯和轉基因動物的能力。通過向合子里直接注射CRISPR/Cas9修飾后的RNA或通過具有CRISPR/Cas9修飾的體細胞核來生產修飾豬胚胎，如，將人白蛋白cDNA通過CRISPR/Cas9系統技術導入到豬體細胞核內，從而使豬產生了人血清白蛋白，可用于治療人血液相關的一些疾病。CRISPR/Cas9系統技術還用于靶向豬受精卵中的血管性血友病因子基因（von Willebrand factor，vWF）來模擬人類血管性血友病。也有一些研究表明，經基因編輯后的豬作為人類疾病的模型用來研究動脈硬化、糖尿病和肥胖癥、苯丙酮尿癥以及癌癥的治療方法是可行的。杜氏肌營養不良癥（Duchenne muscle dystrophy，DMD）和貝克肌營養不良（Becker Muscle Dystrophy，BMD）都屬于肌肉萎縮癥，是人類遺傳性肌肉營養不良癥，是一種不治之癥，由編碼營養不良素中的DMD基因突變引起，通過使用CRISPR/Cas9系統注射豬受精卵成功靶向了DMD基因，導致了DMD特異性表型，說明DMD修飾的小型豬是一種可靠且有用的動物疾病模型，可以概括人類的DMD/BMD形態表型。

黑皮質素受體3（Melanocortin 3 Receptors，MC3R）屬于黑皮質素受體家族（melanocortin receptor family）成員，是神經性黑皮質素受體，MC3R主要在下丘腦中表達，也可以在胎盤、腸、心臟、腎臟和腹膜巨噬細胞中發現，在許多生理過程中起著至關重要的作用，包括脂肪代謝、能量穩態和免疫反應等。目前，在人類基因組中已經發現了41個以上的位點與肥胖癥有關，這其中就包括了MC3R基因，為了進一步研究MC3R的生理功能，使用CRISPR/Cas9系統和SCNT技術生產出了MC3R基因敲除（MC3Rknock out，MC3R-KO）豬，經分析其生長性能數據發現MC3R-KO豬的體重和脂肪率均顯著高于對照組，同時還發現MC3R-KO豬出現了肥胖表型，這一結論使得豬成為了研究人類肥胖癥的潛在模型，對未來的研究具有非常重要的價值。

2.2 CRISPR/Cas9系統技術對豬器官的異種移植研究

人類預期壽命的延長，導致了慢性疾病和器官衰竭患者數量的增加，器官移植是治療終末期器官衰竭的有效途徑，但人體器官的供需不平衡是現代器官移植學中的一個矛盾問題，異種移植是減少或消除這一矛盾最有效的方法之一。異種移植指不同物種共患細胞、組織或器官移植、植入或輸注給受體（一般指人體）的任何程序。家豬被認為是最適合供給人體器官的物種，豬器官與人類器官的生理高度相似性使得將豬作為健康供體移植到人類患者體內成為可能，在某種情況下是不可替代的一類工具。第一批基因敲除豬是為異種移植應用而設計的，基因組編輯系統的使用允許對多個等位基因和基因進行編輯，稱為多路復用，這允許快速生成攜帶多種基因修飾的轉基因豬，以改進異種移植豬模型。選擇豬作為供體動物有以下幾點原因：1）產仔數較大，生長周期短；2）器官大小和生理上與人非常相近；3）人畜共患病傳播的風險較低。然而，人體的免疫屏障對植入的異種器官引發的排斥反應，阻礙了豬器官的直接異種移植。有研究表明，采用CRISPR/Cas9系統技術，引入適當的修飾手段到豬基因組，可以有效減少異種移植的排斥反應，可能使豬的異種移植更接近于臨床應用。哥倫比亞大學轉化免疫學中心的研究學者，利用豬器官做異種移植的實驗以狒狒為研究對象，通過α-1，3-半乳糖轉移酶基因（α-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）敲除的供體和帶血管化胸腺組織的共移植，實現了維持狒狒豬腎異種移植的存活時間達83 d，后采用改良的免疫抑制方法，給受體移植了CRISPR/Cas9系統修飾后的豬腎臟，隨著器官的生長，出現了血清肌酐升高，但沒有組織學或免疫學上的排斥反應證據，并將狒狒的平均生存期增加至125 d。

2.3 CRISPR/Cas9系統技術治療豬疾病的研究

CRISPR/Cas9系統技術是新開發的基于可編程核酸內切酶的基因工程工具，相較以前的技術手段更高效、更便宜、更簡單，漸漸壟斷了基因編輯領域。使用CRISPR/Cas9系統已經產生了許多轉基因動物，如zebrafish，Drosophila，mouse和monkeys等。對豬CD163基因進行DNA編輯后，培養出的個體對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus，PRRSV）具有一定的抗性，這一研究結果在豬生產上有很大的應用前景。在豬Rosa26位點通過CRISPR/Cas9系統技術敲入抗病毒小發夾RNA（Small hairpin RNA，shRNA），然后采用SCNT技術制備了抗豬瘟病毒轉基因（anti classical swine fever virus transgenic，TG）豬，這些TG豬可以有效限制豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）的復制，降低豬瘟相關的臨床癥狀和死亡率，且抗病能力可以穩定地遺傳給F1代，利用TG豬可以減少CSFV給養豬業帶來的經濟損失，這一抗病毒方法為國內其他物種的抗病毒研究提供了參考依據。塞內加谷病毒（Seneca valley virus，SVV）是一種新興的RNA病毒，屬于小核糖核酸病毒科塞內卡病毒屬，感染后會導致豬出現水皰病，其臨床癥狀與口蹄疫相似，給養豬業會造成重大的經濟損失。維甲酸誘導基因I（Retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）是先天免疫系統中的關鍵細胞溶膠受體，在不同的病毒感染過程中扮演不同的角色。在豬的轉基因研究中，使用CRISPR/Cas9系統生成了具有先天免疫系統的RIG-I KO豬細胞系，經對照實驗發現，RIG-I的表達在RIG-IKO細胞中被完全破壞，大大增加了SVV的傳播；且RIG-I負責感知SVV和激活SVV感染細胞中的I型干擾素途徑，RIG-I的過表達顯著抑制了SVV的傳播，從而降低了SVV病毒的感染率。以上研究結論給了科學家一些新的研究思路，RIG-I作為一個潛在的靶點，在正在開發的一種可用作預防SVV傳播的潛在疫苗的過程中，利用CRISPR/Cas9系統來修飾細胞系，可以提高疫苗中的病毒產量，有效疫苗的研發成功將大大降低SVV病毒給養豬業帶來的經濟損失。近幾年，非洲豬瘟的傳播導致國內養殖企業受到了嚴重的經濟損失，依據CRISPR/Cas9系統的研究理論，生產出預防非洲豬瘟傳播的疫苗指日可待。

2.4 CRISPR/Cas9系統技術對豬遺傳育種的應用研究

豬的基因組編輯在豬生產中有著重大的潛在應用價值，基于CRISPR/Cas9系統技術的基因組工程將加速畜禽的繁殖和性狀改良。將外源基因整合到不同基因組中通常會導致表達不穩定、基因沉默和不可預測的基因表達模式，且在某些情況下，這個過程是會被誘變的，因此生產帶有特定基因組位點整合的外源基因動物更有效。我國本地豬種如寧鄉豬、東北民豬均屬于脂肪型品種，能生產出倍受人民大眾歡迎的豬肉，但這些豬品種的脂肪含量過高、瘦肉率低，改善這些品種的脂肪性狀是提高豬肉生產的必要步驟。小鼠體內UCP1基因負責褐色脂肪組織的介導生熱作用，在抵御寒冷和調節能量穩態中起著關鍵作用，并且能夠減少脂肪存儲。有學者依據這一研究結論，結合SCNT技術，通過CRISPR/Cas9技術介導，將小鼠脂聯素-UCP1高效插入豬內源性UCP1基因座，由此產生的UCP1-KI豬相比未經處理的豬，脂肪率和背膘厚顯著降低，但日常能量需求、飼料轉化率及體力水平均沒有降低，UCP1-KI豬能較好地維持體溫，可以降低豬脂肪沉積和提高瘦肉率，這種轉基因豬模型的發展，不僅對豬的性狀改良有重要意義，還可以提高豬的經濟價值。肌生成抑制素（Myostatin，MSTN）作為轉化生長因子-β超家族的一員，是肌肉生長的負調控因子，在改善家畜生長性能方面具有重要的前景。有研究表明MSTN敲除（knock-out）小鼠的肌肉質量比野生型的小鼠大得多，MSTN自然突變的牛品種表現出更大的肌肉量,而豬MSTN基因在進化過程中經歷的選擇過程與牛羊的MSTN基因有些不同，可能是因為MSTN基因在豬身上表現出不同的表達模式，起不同的作用。豬是世界上最重要的畜禽之一，而中國的豬肉消費量尤其巨大，因此，構建MSTN基因敲除豬對研究肌肉發育和肉用性能的影響具有重要意義。通過高效的CRISPR/Cas9技術系統和SCNT，生產出的MSTN-KO仔豬與同窩仔豬相比，出生體重增加了15%，CRISPR/Cas9誘導的突變可破壞MSTN的功能，MSTN-KO豬模型有望在將來產生更大的肌肉量，提升養殖效益。由于天生缺乏完善的免疫系統，新生仔豬很容易感染致病因子導致死亡，全球每年因此造成經濟損失高達數十億美元。母豬初乳中所特有的乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種具有免疫活性的乳蛋白，仔豬吃過初乳后可獲得被動免疫，LF有助于在腸黏膜上方形成保護層，并利于仔豬發育的抗菌和抗病毒活性，因此仔豬遭受腸炎或腹瀉的概率較小，但是隨著泌乳期的增加，母豬乳汁中的LF分泌量會減少，生產上常用LF人工補充仔豬日糧來促進仔豬的生長。通過CRISPR/Cas9系統介導的同源重組，在豬酪蛋白ɑ-s1（Casein alpha-s1，CSN1S1）基因的3’端具有無標記的LF基因位點特異性敲入，乳鐵蛋白可以在酪蛋白ɑ-s1啟動子的控制下在乳腺中過表達，且在分泌的初乳和常乳中均持續高表達，與對照組相比，轉基因豬的乳汁具有抑菌作用，這一研究成果為豬的育種工作提供了新的研究思路。

隨著對基因組的深入研究，功能性LncRNA的鑒定成了當前研究中的一個熱點，尤其已發現數萬個與肌肉發育相關的LncRNA，通過高通量測序技術可進一步探索其功能。近年來，通過CRISPR/Cas9系統之類的基因編輯技術可以在體內和體外鑒定功能性LncRNA，針對LncRNA的sgRNA文庫的構建和肌肉細胞的有效篩選系統的建立，將有利于骨骼肌中關鍵功能性LncRNA的篩選，這些發現將為豬肉品質改良的機理研究提供參考依據。

3 展望

CRISPR/Cas9基因編輯技術效率高、操作方便，該技術在豬身上的廣泛應用，為豬經濟性狀的快速改善帶來了機遇，具有非常重要的應用價值?；贑RISPR/Cas9的基因編輯工具的出現，為研究人員提供了以更精確和有效的方式，來提高改良豬品種的能力。然而，大多數針對豬品種改良的基因編輯工作，仍處于闡明基因組功能和調控機制階段，并沒有滿足豬基因組編輯的所有要求。如CRISPR/Cas9系統可以有效地在同一胚胎內同時靶向兩個基因，唯一的額外步驟是需引入一個帶有crRNA的CRISPR，這說明與其他大范圍核酸酶相比，破壞多重基因更容易，這說明該技術可用于靶向可能具有補償作用的基因簇或基因家族，因此除非所有基因都被破壞，否則很難確定單個基因的作用?；谶@個理論，CRISPR/Cas9技術可以通過提高體細胞中基因靶向的效率和直接通過受精卵注射來產生轉基因豬。隨著生物技術的不斷改進，其在保護不同品種的豬、提高飼料效率和豬肉產量以及未來開發抗生素替代品方面具有廣闊的前景。