PRRSV類NADC30感染狀態下母豬血液內毒素水平變化規律

趙星嵐，梁嘉婧，李亞杰，王 碩，張夢然，胡文翔，吳晨晨

（西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊陵 712100）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種嚴重危害全球養豬業的疾病，妊娠母豬易感。臨床上分為急性型、慢性型和亞臨診型，其中慢性型PRRS是在規模化豬場的主要表現形式，PRRSV可在豬體內持續幾個月甚至更長時間，但臨床癥狀不明顯。近年來，我國陸續報道PRRSV類NADC30毒株的流行和類NADC34毒株的出現，給豬場PRRS防控帶來新的挑戰。感染豬藍耳病后，豬體會長時間帶毒，導致機體免疫功能受到抑制，容易繼發感染細菌性疾病，如沙門氏菌，鏈球菌病和大腸桿菌等。細菌內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁的一種成分，細菌在存活狀態時不能釋放出來，只有當細菌死亡、自溶或黏附在其他細胞時，才表現其毒性，內毒素的主要化學成分是脂多糖。很多報道中均發現了豬藍耳病與革蘭氏陰性菌混合感染的情況。試驗主要監測了感染豬藍耳病的豬場和健康豬場，通過分析2個豬場內毒素水平的變化規律，進一步確診內毒素對母豬繁殖性能的影響，以期明確豬只感染豬藍耳病病毒后混合感染的細菌對豬場繁殖性能的影響，也為以后規模化豬場豬藍耳病的監測提供科學依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗選擇了西北地區生物安全基礎較好的2個同等規模的母豬場，均是按照豬藍耳病陽性穩定豬場進行管理，免疫程序基本一致。豬場1母豬血液檢測檢出PRRSV 類NCDC30陽性，豬場2為豬場1的正常對照豬場，豬血液中未檢測出任何豬藍耳病病原。分別選取2個豬場妊娠3周、6周、9周、12周和15周的母豬，每場各6頭進行前腔靜脈采血，每頭5 mL，采集完畢后置于離心機，在3 000 r/min條件下離心20 min，用于分離血清/血漿，-20℃冰箱凍存備檢。收集血漿進行豬藍耳病抗原、抗體水平的監測以及內毒素、降鈣素原和超敏C蛋白水平的分析，同時，實時記錄母豬妊娠周齡的流產率等情況。

1.2 主要試劑

采集豬血及血清檢測實驗操作中所使用到的相關化學試劑見表1。

表1 主要化學試劑

1.3 主要儀器設備

采集豬血及血清檢測實驗操作中所使用到的相關儀器設備見表2。

表2 主要儀器設備

1.4 ELISA樣品檢測方法

實驗開始前20 min從冰箱中將備檢血清應用ELISA方法檢測各個妊娠階段母豬的豬藍耳病抗體、內毒素（LPS）、降鈣素原（PCT）和超敏C蛋白（hs-CRP）。具體操作步驟如下：打開鋁箔密封袋，小心取出包被板，使用自封袋將計劃未使用的包被板封閉完好后放回冰箱；分別設置標準品孔、空白孔（不加血清、稀釋液和酶標試劑）和待測血清孔，標準品孔依次加不同濃度（按濃度高低順序依次加樣）的標準品50 μL ；血清5倍稀釋：先加備檢豬只血清10 μL于樣品孔中，再加40 μL稀釋液；標準品孔和樣品孔中每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL，封板膜封孔完好后，放于恒溫箱（提前30 min打開，設置為37℃）中溫育60 min；洗滌：溫育完畢后棄去液體，濾紙上拍打甩干，加滿提前配好的洗滌液（使用純水稀釋20×濃縮洗滌液至1倍），靜置40 s，倒掉洗滌液，濾紙上拍打甩干，反復洗滌5次（也可用洗板機洗滌包被板）；每孔加入顯色劑A、B各50 μL，輕輕震蕩后封板，于37℃避光條件下溫育15 min；溫育完畢后加入終止液50 μL，使用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的OD值，此操作在15 min內完成。

1.5 數據統計與分析

實驗數據由軟件ELISACalc回歸擬合計算程序計算獲得，采用SPSS 26.0軟件中的One-Way ANOVA進行分析，對比各個母豬場間同階段數據的差異性。a,b,c代表不同字母的值差異顯著（P＜ 0.05）， 利 用 軟 件 GraphPad Prism 5.0作圖，所制作的圖像以平均數（X）±標準差（SD）形式表示。

2 結果

2.1 豬場1與豬場2豬繁殖與呼吸綜合征的病原、抗體檢測結果

從表3結果發現，豬場1母豬與豬場2母豬，各個周齡妊娠母豬檢測抗體水平均呈陽性；單一從豬場2的數據看，豬藍耳病疫苗免疫后豬群抗體陽性率為100%，揭示免疫豬藍耳病疫苗后豬群可以產生抗體，鑒于豬場1檢測時已經確認該豬場有PRRSV類NADC30檢出，據此不能完全判斷豬場1的抗體陽性率100%是正常免疫導致的，可能存在PRRSV類NADC30感染后導致的抗體出現，需要進一步評估。

表3 2個母豬場豬藍耳病毒抗體結果檢測

對送檢的樣本進行PRRSV類NADC30及PRRSV-歐洲株的檢測（見表4），豬場1妊娠3周、6周、9周、12周、15周母豬的血清中均檢測出PRRSV類NADC30病原，PRRSV-歐洲株未檢出；豬場2作為對照組PRRSV類NADC30及PRRSV-歐洲株均未檢出，提示目前的豬場1存在PRRSV類NADC30感染的情況。

表4 2個母豬場豬藍耳病病毒抗原結果檢測

2.2 妊娠母豬階段流產率的統計

對豬場1妊娠母豬流產情況按照妊娠0—3周、4—6周、7—9周、10—12周、13周以上進行統計（見圖1），共統計325頭流產母豬，其中母豬妊娠0—3周齡流產數量為9頭，流產比率為2.77%；母豬妊娠4—6周齡流產數量為45頭，流產比率為13.85%；母豬妊娠7—9周齡流產數量為123頭，流產比率為37.85%；母豬妊娠10—12周齡流產數量為63頭，流產比率為19.38%；母豬妊娠13周齡以上流產數量為85頭，流產比率為26.15%，其中妊娠7周以上的流產母豬合計占比83.38%，說明豬場流產主要集中在妊娠中后期的母豬，同時對于妊娠早期（6周前）的母豬也有一定的影響，流產率占比為16.62%。

圖1 豬場1妊娠母豬階段流產數目和比率

2.3 母豬內毒素、降鈣素原和超敏C蛋白的水平

對2個豬場的妊娠母豬的LPS的含量進行檢測分析（見圖2），發現豬場1母豬妊娠9周齡、12周齡、15周齡血液中內毒素的含量顯著高于同豬場妊娠3周、6周母豬水平（P＜0.05），這與圖1顯示的妊娠7周以上的流產母豬合計占比83.38%的高流產率的結果呈現明顯的正相關，暗示革蘭氏陰性菌在豬藍耳病發病期間可能加劇了豬場母豬的發病流產的程度，與豬場2妊娠正常母豬對照群比較，差異也十分顯著 （P＜0.05），進一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍耳病感染后的流產程度。

圖2 2個豬場母豬血液內毒素、超敏C蛋白和降鈣素原的含量

對豬場1和豬場2的母豬群的hs-CRP的含量進行檢測分析，發現2個豬場的母豬在妊娠3周齡、6周齡、9周齡、12周齡和15周齡血液hs-CRP的含量之間無顯著性差異（P＞0.05）。

對豬場1和豬場2的母豬群PCT的含量進行監測分析，發現豬場1流產母豬血液PCT的含量顯著高于同群未流產母豬，同樣流產母豬血液PCT的含量也明顯高于豬場2的對照母豬群血液PCT的含量；與此同時，妊娠9周齡血液中豬降鈣素原的含量顯著高于同豬場其他妊娠周齡的母豬群（P＜0.05），這與LPS的檢測結果的趨勢一致，進一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍耳病感染后的流產程度。

3 討論

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由PRRSV感染而引起的一種烈性傳染病，患病母豬通常會產生早產、流產以及死胎數增加等不良臨床表現，給養豬業帶來巨大的損失。豬藍耳病感染后機體的免疫能力會降低，進而導致了豬體的抗病能力下降，容易繼發感染細菌性疾病，加重病情的發展。相關報道了母豬易繼發感染沙門氏菌、大腸桿菌、巴氏桿菌等大量的革蘭氏陰性菌，細菌不斷在豬體內生長繁殖并黏附在其他細胞上可釋放大量內毒素，進入血液中引起內毒素血癥，加劇病情的發生發展，因此通過監測內毒素的變化對于進一步印證豬場感染豬藍耳病后是否存在細菌的混合感染，大量細菌的繁殖增生是否釋放其毒素，加重對其豬只免疫系統的破壞具有明顯的診斷意義。在本案例中，通過前期的病原篩查已經確認了豬場1有PRRSV NADC30的陽性檢出，同時豬群也出現明顯的流產癥狀，這對于分析豬藍耳病感染后的內毒素的變化提供了具有直接生產指導意義的數據分析基礎，與此同時，在同地區的未檢出PRRSV NADC30陽性的豬場2在豬場設計工藝、生物安全基礎、飼養規模、飼養管理方式，生產節律以及免疫程序都是基本一致的，這也為本次科學分析內毒素在豬藍耳病感染中的繼發影響最大程度提供了客觀的可比性。經查閱資料，本次對比分析中優先選取了內毒素、超敏C蛋白和降鈣素原，從目前的實驗室研究結果看，這3個指標具備明顯典型性，符合作為有效臨床監測指標準確性、靈敏性及快速性的特點。超敏C反應蛋白是由肝臟合成的全身性炎癥反應急性期的非特異性標志物，在臨床上常作為鑒別是否是細菌感染主導還是病毒感染主導的重要監測指標。在本案例中，2個豬場的母豬在妊娠3周齡、6周齡、9周齡、12周齡和15周齡血液hs-CRP的含量之間均無顯著性差異（P＞0.05），提示豬場1的發病主因是病毒性感染為主。LPS與PCT均是細菌感染程度分析的重要指標。內毒素的主要化學成分是脂多糖，與革蘭氏陰性菌的感染程度有明顯的正相關性。降鈣素原是一種蛋白質，當嚴重細菌、真菌、寄生蟲感染以及膿毒血癥和多器官功能衰竭時其在血漿中的水平升高，局部有限的細菌感染、輕微的感染和慢性炎癥不會導致其升高。豬場1母豬妊娠9周齡、12周齡、15周齡血液中內毒素的含量顯著高于同豬場妊娠3周、6周的母豬群（P＜0.05），這與妊娠7周以上的流產母豬合計占比83.38%的高流產率的結果呈現明顯的正相關，與豬場2妊娠正常母豬對照群比較，差異也十分顯著，證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍耳病感染后的流產程度，且對妊娠中后期的母豬影響高于對妊娠早期母豬的影響。豬場1流產母豬血液PCT的含量顯著高于同群未流產母豬，與此同時流產母豬血液PCT的含量也明顯高于豬場2的對照母豬群血液PCT的含量；妊娠9周齡母豬血液中豬降鈣素原的含量顯著高于同豬場其他妊娠周齡的母豬群，這與LPS的檢測結果的趨勢一致，進一步證實革蘭氏陰性菌會加劇豬藍耳感染后的流產程度。

經過系統的對比分析，可以確定豬場1的感染主要以病毒感染為主，細菌感染參與了繼發感染，加劇了臨床發病的速度以及流產的嚴重程度，這與豬場的實際生產數據變化高度一致。一個有效的監測指標在生產實踐過程中對疾病的早期發現、早期診斷具有明顯的實際意義和經濟意義，因此選擇靈敏度高、穩定、快速、典型的監測指標一直是一線生產者、獸醫等從業人員關注的重點。內毒素、超敏C蛋白和降鈣素原這3個指標可以快速地進行豬場疾病的分型以及對疾病發展程度進行初步準確的判斷，結合豬場的實際情況，以及后續的實驗室檢測結果，更加精準地進行疾病的防控。與此同時，在生產實踐中很多情況發生疾病的原因是多樣性的，因此單一的檢測某一指標已經跟不上豬場的需求，綜合性的檢測分析是豬場未來檢測的重點，據此，本次對比分析不僅為解決當前發生問題的控制提供了至關重要的決策依據，還建立了完整的、完全符合養豬生產特點的綜合性診斷方法，為以后規模化豬場的病毒和細菌性疾病的監測提供數據支持，也為提高豬場的健康養殖奠定了科學基礎。