海藻寡糖的生理活性與酶法轉化研究進展

朱玥明， 陳 朋， 劉德川，2， 孫媛霞*

（1.中國科學院 天津工業生物技術研究所，天津 300308；2.中國科學院大學，北京 100049）

我國大型海藻主要包括褐藻、紅藻、綠藻和藍藻等4大類，產量極其豐富，2019年我國養殖產量達253.8萬t，超過世界藻類養殖總產量的50%[1]。褐藻、紅藻是我國最重要的經濟藻類，2019年褐藻中海帶、裙帶菜、羊棲菜產量分別為162.4萬t、20.2萬t和2.7萬t，紅藻中江蘺、紫菜、麒麟菜產量分別為34.8萬t、21.2萬t和0.042萬t[1]。海藻多糖是海藻細胞壁的主要成分，褐藻中多糖主要為褐藻膠和褐藻糖膠（巖藻膠），紅藻中多糖主要為瓊膠和卡拉膠，4種多糖的結構式見圖1。海藻多糖具有一定的生理學功能，例如褐藻裙帶菜中分離出的巖藻多糖可以刺激巨噬細胞產生細胞因子和趨化因子[2]；紅藻紫菜和江蘺中提取的多糖在體外和體內都具有巨噬細胞刺激活性[3]。但是，海藻多糖溶解度差、相對分子質量大，不能被生命體直接吸收利用，導致其生物學功能不能充分發揮，同時限制了海藻資源的高值化應用。

圖1 4種海藻多糖的分子結構Fig.1 Molecular structures of four seaweed polysaccharides

據統計，我國海藻資源的應用目前主要集中于食用方面，其加工技術主要涉及食品、飲品、食品添加劑、調味品的制備方法[4]。2019年我國海藻加工品達115.2萬t，加工比例僅為45.4%[1]。海藻多糖經物理、化學、生物等方法可降解為海藻寡糖，其溶解性和生物學活性顯著提升。例如，褐藻膠降解而成的褐藻寡糖是一種新型的植物刺激劑，對農作物具有多種生物學功能，如促進作物生長、誘導抗逆及抗病、提高產量和品質、延長貨架期等[5]；同時褐藻寡糖對人類健康具有多種有益功能，如免疫調節活性、抗菌活性、抗氧化、抗腫瘤、抗高血壓、抗糖尿病等[6]。隨著海藻寡糖的特殊生理學功能被認知，其應用將擴展至保健品、醫藥、飼料、農業等諸多領域，從而帶動海藻的高值化加工的發展。

降解海藻多糖的傳統制備方式是利用物理或化學方法，通過高溫、高壓、加酸、加堿等手段獲得，存在反應條件難控制、降解不徹底導致收率低、生物活性遭到破壞等問題。利用生物法降解海藻多糖，具有效率高、成本低、條件溫和、基本無污染，降解徹底、寡糖聚合度可控、最大程度保留生物活性成分等優勢。作者將從海藻寡糖生物活性和生物綠色制備技術兩個方面展開，為海藻資源的高值化利用提供一定參考。

1 海藻寡糖的生理活性

海藻多糖經降解而成的海藻寡糖，由于其相對分子質量和黏度顯著降低，具有更佳的溶解性和生物利用度，且表現出更顯著的生理學活性，主要包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、免疫調節等幾個方面，見圖2。以下綜述褐藻寡糖、瓊膠寡糖、卡拉膠寡糖、巖藻寡糖4種典型海洋寡糖的生物學功能。

圖2 海藻寡糖的生理活性Fig.2 Physiological activities of seaweed oligosaccharides

1.1 褐藻寡糖及其生理活性

褐藻寡糖（alginate oligosaccharides，AOS）是褐藻細胞壁成分褐藻膠（褐藻酸、褐藻多糖）的降解產物[7]。褐藻膠是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-1，4-mannuronic acid，簡稱M）和α-L-古羅糖醛酸（α-L-1，4-guluronicacid，簡稱G）以1，4糖苷鍵非均聚形成的線性分子。根據2種糖的組合方式不同，褐藻膠具有3種結構單元，聚甘露糖醛酸片段（polymannuronic acid，PM）、聚 古 羅 糖 醛 酸 片 段（polyguluronic acid，PG）以及甘露糖醛酸與古羅糖醛酸的交替片段（PMG）。

AOS具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、免疫調節等多種生物活性[8]。Falkeborg等發現AOS在鐵誘導氧化乳化亞油酸過程中表現出良好的抗氧化活性，能夠完全抑制硫代巴比妥酸反應性物質（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）的形成；AOS不僅能清除穩定的ABTS自由基，還能清除羥自由基（OH·）和超氧自由基（O2-·），清除率分別為99.5%、90%和87%[9]。相對分子質量和G/M比值是影響AOS抗氧化活性的兩個重要因素。研究發現，相對分子質量較小的AOS具有更顯著的抗氧化活性和清除羥自由基的能力[10]；Ramos等發現G/M比值較低的AOS表現出較好的DPPH自由基清除活性[11]。AOS具有明顯的抗腫瘤活性，Chen等研究了AOS對骨肉瘤患者術后的抗腫瘤作用，發現褐藻五糖在體外對骨肉瘤的生長具有顯著的抑制作用，它可以通過提高血清中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）的水平來改善患者血液的抗氧化性能，并降低血清中丙氨酸轉氨酶（alanine transaminase，ALT）和天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平[12]。AOS的免疫調節活性主要體現在其對細胞因子的誘導作用。Iwamoto等研究發現褐藻寡糖G8和M7對RAW264.7細胞誘導細胞因子的的活性最強[13]；Yamamoto等報道甘露酸寡聚物可誘導多種細胞因子的產生和分泌，如腫瘤壞死因子-α（TNFα）、粒細胞集落刺激因子（GCSF）和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）[14]。AOS的結構特征，尤其是其末端不飽和結構、分子大小和M/G比在決定巨噬細胞激活效應中發揮重要作用[15]。AOS具有的多種生理學功能使得其在功能食品、保健品、新藥開發等領域具有很大的潛力。

最近的研究發現，AOS對植物具有很強的誘導生長、增強抗逆作用。李佳琪等研究發現AOS能夠促進黃瓜幼苗的生長，且相對分子質量為8 000的褐藻寡糖處理的效果最好[16]；陳芊如等發現褐藻寡糖中濃度處理對煙草生長效果最佳[17]；Natsume等發現AOS可以促進大麥根系的生長尤其是胚根的生長[18]；Ma等發現AOS能提高豌豆的發芽率[19]。在植物防御環境脅迫中，AOS可以作為防御反應的信號分子。Liu等人發現0.2%的AOS能增強番茄對干旱脅迫的耐受性[20]。因此，AOS可作為一種新型的植物刺激劑，目前已經開始應用于農業領域[21]。

1.2 瓊膠寡糖及其生理活性

瓊膠寡糖（agar oligosaccharides，AGOS）是紅藻細胞壁組分瓊膠（瓊脂）的降解產物，根據斷裂位置不同可分為瓊寡糖（agaroligosaccharides）和新瓊寡糖（neoagarooligosaccharides）兩大類。瓊脂由瓊脂糖（agarose）和瓊脂膠（agaropectin）組成，瓊脂糖的主要結構由β-D-半乳糖和3，6-脫水-α-L-半乳糖的重復單元組成，硫酸酯質量分數低于0.15%；瓊脂膠具有與瓊脂糖相同的二糖重復單元，但某些3，6-脫水-α-L-半乳糖殘基的羥基被亞砜或甲氧基和丙酮酸殘基取代，硫酸鹽質量分數高達5%~8%[22]。

AGOS具有多種特殊生理活性，受到越來越多的關注。AGOS具有益生元效果，可以抑制有害菌的生長，同時促進有益菌的增殖。Enoki等人發現瓊脂二糖具有明顯的抗菌活性，可以保持食物新鮮[23]；Tatsuji等發現新瓊寡糖可抑制某些有害細菌的增殖和生長[24]；新瓊寡糖可促進雙歧桿菌、乳酸桿菌、德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌的生長和增殖[25-26]。因此，AGOS有望作為一種新的益生元改善腸道微環境，可應用于新型功能性食品或食品添加劑開發。AGOS具有明顯的抗氧化活性，Chen等人研究發現以瓊二糖為主的瓊膠寡糖可以有效消除自由基[27]；趙雪等人發現以二糖、四糖為主的瓊膠寡糖具有極好的清除O2-·，OH·和DPPH·的能力[28]；Zhang等研究發現新瓊寡糖的聚合度會影響其抗氧化能力[26]。AGOS具有抗腫瘤和抗炎活性，Higashimura等發現瓊寡糖可以抑制前列腺素PEG2和TNF-α的產生，進而抑制腫瘤細胞的生長[29]，還指出瓊二糖對前列腺素PEG2的抑制率為75%[30]；AGOS對TNF-X、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子也有抑制作用。可見，AGOS在新藥開發領域具有巨大潛力。

除此之外，AGOS在農業領域也具有很大的應用潛力。AGOS可以增強普通小麥對干旱脅迫的耐受性，并促進根系生長[31]；陳芊如等對比3種海洋寡糖對植物生長的促進作用，發現AGOS對煙株生長發育的促進作用最為顯著[17]；李倩等發現，0.02%的AGOS顯著促進了秋葵植株的生長并提高了果實產量和營養品質[32]。

1.3 卡拉膠寡糖及其生理活性

卡拉膠寡糖（carrageenan oligosaccharides，COS）是紅藻多糖卡拉膠的降解產物。卡拉膠為線性硫酸多糖結構，由交替的3-β-D-吡喃半乳糖和4-α-D-吡喃半乳糖或4-3，6-脫水-α-D-吡喃半乳糖組成重復的雙糖單元。卡拉膠可分為λ型、ι型和κ型3大類。

COS具有多種生理活性，包括抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗炎和抗凝活性[33]。Sun等人發現COS可有效消除自由基并表現出顯著的抗氧化活性[34]，Yuan等人發現COS的硫酸化衍生物具有更高的抗氧化活性[35]。Yuan等發現COS可顯著抑制可移植肉瘤細胞S180的生長，促進巨噬細胞吞噬、脾細胞分泌抗體、脾淋巴細胞增殖、NK細胞活性以及血清中IL-2和TNF-α水平的增加[36]。Yao等發現COS可以抑制ECV304細胞的增殖、遷移和成管，并且可以抑制CAM模型中新血管的生長。COS在S180和MCF-7異種移植模型中均顯示出較強的抗腫瘤活性[37]。因此，COS可作為治療腫瘤的新靶分子。COS具有抗病毒功能，相對分子質量和硫酸化程度影響其抗病毒能力。Wang等人研究表明，從卡拉膠多糖中制備的相對分子質量為2 000的COS比5 000的COS能更有效抑制甲型流感病毒H1N1在MDCK細胞中的復制[38]；Qiang等人發現硫酸化程度和相對分子質量是影響λ-卡拉膠低聚糖抗流感病毒IAV活性的主要因素[39]。Xu等人的研究表明，COS可劑量依賴性抑制LPS激活的小膠質細胞釋放的NO、TNFα和IL-10的活性和含量[40]。此外，COS還具有抗菌、抗氧化和細胞保護活性[41-43]。

1.4 巖藻寡糖及其生理活性

巖藻寡糖（fucoidan oligosaccharides，FOS）是巖藻多糖降解的產物。藻類的巖藻多糖結構復雜，單糖的連接、分支、硫酸化位置和組成有很大的不同。盡管許多研究試圖確定巖藻多糖的精細結構，但發現規律性的例子很少。大多數藻類的巖藻多糖主要由硫酸化的L-巖藻糖組成，巖藻糖質量分數約為34%~44%，同時可能含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖和糖醛酸[44]。

FOS具有黏度低、溶解性好、生物利用度高等優點，且具有多種生理活性，在功能食品、新藥等領域顯示出巨大的潛力。Zhao等人比較了FOS和巖藻多糖的抗氧化活性，結果表明寡糖對AAPH誘導的低密度脂蛋白氧化的抑制作用強于多糖[45]。Yang等人研究了水解型FOS作為抗癌劑的作用機理，并對其抗癌活性進行了初步研究，結果表明通過水解降低其相對分子質量可以顯著提高抗癌活性，在1.0 mg/mL質量濃度下，天然褐藻多糖和FOS的抗癌活性分別為37.6%和75.9%，同時水解過程不會引起大量的脫硫[46]。在db/db小鼠中，FOS顯著降低血糖、甘油三酯、膽固醇和低密度脂蛋白水平，并通過降低脂質參數逐漸減輕體質量；同時通過提高糖耐量有效地改善了血糖穩態。研究結果表明，低相對分子質量FOS激活AMPK（AMP activated protein kinase）信號轉導途徑，通過控制內質網應激依賴途徑來預防代謝性疾病，這為改善內質網應激介導的代謝功能障礙提供了一種潛在的治療策略[47]。FOS可作為同種異體免疫損傷的保護劑。文獻[48]報道了注射低相對分子質量的FOS可以防止內膜損傷，而在大鼠心臟移植模型中，注射低相對分子質量的FOS顯示出有效預防同種異體免疫損傷所致的動脈和實質損傷。FOS也可作為心血管疾病血管再生劑，與低相對分子質量肝素和硫酸葡聚糖相比，低相對分子質量的FOS更有效地與P-選擇素的配體結合[49]。此外，FOS在治療高脂血癥、風濕性關節炎和肌細胞增多癥方面也顯示出巨大的潛力[50-52]。

2 海藻寡糖的酶法轉化研究

利用傳統的物理、化學等方法能夠降解海藻多糖來制備海藻寡糖，但收率低，能耗高，且帶來很大的環境污染。利用生物酶法制備海藻寡糖具有效率更高、條件溫和、過程可控、環境友好等優勢，是高效制備海藻寡糖的最有前景的方法。作者以褐藻寡糖和瓊膠寡糖的生物綠色制備為例，介紹海藻多糖降解酶在海藻寡糖制備中的應用，為海藻寡糖的工業化生產提供一定的借鑒意義。

2.1 褐藻寡糖的酶法轉化研究利用褐藻膠裂解酶可將褐藻膠降解為褐藻寡

糖。褐藻膠裂解酶（Alginate lyase）屬于多糖裂解酶家族（PL family），通過β-消除反應降解褐藻膠，產生非還原端雙鍵的不飽和寡糖[53]。根據其降解底物不同，褐藻膠裂解酶可以分為polyM裂解酶、polyG裂解酶和polyMG雙功能裂解酶。根據降解方式不同，褐藻膠裂解酶可分為內切型和外切型褐藻膠裂解酶，內切型褐藻膠裂解酶降解褐藻多糖內部的糖苷鍵，產生不同聚合度的AOS，外切型褐藻膠裂解酶一般以寡糖為底物，從某一末端降解生成單糖。由此可見，內切型、雙功能的褐藻膠裂解酶降解多糖效率更高，更加適合于規模化放大應用。褐藻膠裂解酶主要來源于海洋微生物，表1列出一些雙功能褐藻膠裂解酶的酶學性質。

表1 雙功能褐藻膠裂解酶酶學性質比較Table 1 Comparison of the enzymatic properties of bifunctional alginate lyases

從表1可以看出，不同PL家族、不同來源的雙功能褐藻膠裂解酶在酶活性質和酶活上差異很大。其中嗜極性的酶由于能夠耐受較寬泛的pH和較高的溫度，更適合于產業化應用而備受關注，例如來自Marinimicrobium sp.H1的AlgH-I的最適pH達到10.0[55]，來自Isoptericola halotolerans NJ-05的AlyA最適溫度為55℃[59]。除穩定性之外，比酶活也是決定該酶能否應用于實際生產的一個重要因素，已報道雙功能褐藻膠裂解酶中，AlgH-I和AlgNJU-03表現出很高的比酶活，因此具有很強的應用前景[55，60]。

目前，對褐藻膠裂解酶結構和功能的關系研究越來越深入，已經有27個不同來源的褐藻膠裂解酶的結構被解析[77]。褐藻膠裂解酶的結構可以分為4大類：（α/α）n滾筒、β-螺旋、β-果凍卷折結構和（α/α）n滾筒+反平行β折疊結構[77-78]，見圖3。對褐藻膠裂解酶的三維結構研究有助于酶分子的定向進化，以提高酶活性、增強酶的穩定性，使其更適合應用于褐藻寡糖的工業化生產。Yan等通過結構域優化大幅提升該酶的酶活和熱穩定性，獲得耐熱、耐堿、耐鹽的改造酶，且酶活性不依賴于金屬離子，是一個非常適合工業化生產AOS的工具酶[55]。

圖3 褐藻膠裂解酶的結構解析Fig.3 Structural analysis of alginate lyase

利用褐藻膠裂解酶建立大型褐藻的酶解工藝能夠實現功能性AOS的綠色制備。Li等基于褐藻膠裂解酶的酶解技術開發一種以海帶為原料高效生產AOS的方法，首先利用纖維素酶對干海帶進行預處理，以釋放可發酵糖（8.5 g/L葡萄糖和15.2 g/L甘露醇），然后將表達褐藻膠裂解酶的解脂耶氏酵母工程菌株發酵72 h，葡萄糖和甘露醇供菌體生長被完全消耗，褐藻多糖被裂解酶水解，從發酵上清液中提取獲得聚合度為2~3的AOS[79]，見圖4。Sun等人利用來源Pseudoalteromonas sp.Alg6B的褐藻膠裂解酶與固體纖維素酶混用，建立以海帶等大型褐藻生產AOS的方法，該方法能夠完全降解海帶，水解率高達97%，主要AOS產物為二糖和四糖[80]。

圖4 褐藻寡糖酶法轉化工藝Fig.4 Enzymatic conversion processes of alginate oligosaccharides

2.2 瓊膠寡糖的酶法轉化研究

利用瓊膠酶可以將瓊膠降解為瓊膠寡糖，目前研究發現的大多數瓊膠酶來自海洋微生物。瓊膠酶分為α-瓊膠酶和β-瓊膠酶，分別切割瓊脂糖的α-1，3鍵和β-1，4鍵，生成瓊脂寡糖和新瓊寡糖產物。根據作用方式不同，瓊膠酶可分為內切瓊膠酶和外切瓊膠酶，內切瓊膠酶從糖鏈內部進行降解，生成聚合度為2、4、6的寡糖混合物，而外切瓊膠酶從糖鏈的末端逐步降解，產物聚合度更為均一。瓊膠酶屬于糖苷水解酶家族，包括GH16、GH50、GH86、GH96和GH118等 家 族[83]，以GH16和GH50家族的β-瓊膠酶為例，對其酶學性質和產物做一介紹，見表2。

表2 瓊膠酶（GH16和GH50家族）酶學性質比較Table 2 Comparison of the enzymatic properties of agarases(GH16 and GH50 families)

從表2可以看出，大多數瓊膠酶最適pH為6.0~8.0，最適溫度為30~50℃。由于瓊膠在低溫下會凝結成凍狀，因此最適溫度較高，且熱穩定性較強的瓊膠酶才有應用前景，如來自Marinimicrobium sp.H1的內切型瓊膠酶AgaA的最適溫度達到60℃，非常適合瓊膠底物的液化[84]。GH16家族的瓊膠酶為內切型，終產物為聚合度2、4、6的新瓊寡糖的混合物；GH50家族的瓊膠酶為外切型，終產物聚合度較均一（2或4）。

利用瓊膠酶以瓊脂為底物制備瓊膠寡糖的關鍵是如何快速使瓊膠底物溶解，進而加速酶水解的效率。Yan等建立組合利用特異性瓊膠酶制備均一新瓊二糖的新策略，首先利用熱穩瓊膠酶AgaA將瓊脂底物快速液化（瓊膠液化模塊），然后利用外切型瓊膠酶AgaB將產物相對分子質量均一化，生成終產物新瓊二糖（寡糖均一化模塊）；由于AgaB對硫酸酯化的瓊脂糖也具有水解活性，利用該策略可直接以硫酸酯化程度較高的紅藻多糖為底物進行反應，制備新瓊二糖[84]。Song等建立瓊膠酶雞尾酒策略，探索具有最高協同效應的酶比例和酶解條件，以大型紅藻石花菜為原料實現新瓊寡糖的生產[102]，見圖5。JEON等利用谷氨酸棒桿菌構建瓊膠酶的分泌表達工程菌株，實現瓊膠酶的胞外高水平表達（最高酶產量達1.53 g/L），應用于新瓊二糖的生產，大幅降低了產酶成本[103]。

圖5 瓊膠寡糖酶法轉化工藝（以新瓊二糖為例）Fig.5 Enzymatic conversion processes of neoagarooligosaccharides(with NA2 as example)

2.3 其他海藻寡糖的酶法轉化研究

卡拉膠酶可以將卡拉膠降解為卡拉膠寡糖，根據其底物特異性可分別分為3類，即λ-卡拉膠酶、ι-卡拉膠酶和κ-卡拉膠酶[104]。卡拉膠酶都是內切酶，能夠切割卡拉膠的內部β-1，4-糖苷鍵并產生一系列偶數的寡糖。Duan等開發了一種利用纖維素酶和重組κ-卡拉膠酶直接從麒麟菜中制備卡拉膠寡糖的高效方法[105]。Yao等人利用來自溶纖藻菌株N5-2的卡拉膠酶從κ-卡拉膠中制備了κ-新卡拉二糖硫酸鹽、κ-新卡拉六糖硫酸鹽和κ-新卡拉八糖硫酸鹽的混合物[106]。

巖藻多糖酶可以降解巖藻多糖生成巖藻寡糖。Bakunina等發現，檸檬假交替單胞菌的巖藻多糖酶在pH 6.5~7.0范圍內能有效降解巖藻多糖，形成硫酸化的α-L-巖藻寡糖[107]。Wang等提純了一種新的巖藻多糖酶，并利用其水解巖藻多糖。結果表明，該巖藻多糖酶可直接水解不經脫硫處理的巖藻多糖，生成巖藻寡糖的聚合度為2~10[108]。

除此之外，降解紫菜多糖、褐藻淀粉、石莼多糖等海藻多糖的降解酶也被廣泛研究，應用于相應海藻寡糖的酶法制備中[109]。

3 展望

海藻寡糖因其具有獨特結構與生理學特性越來越受到人們的關注，已經或有望應用于健康食品、保健品、醫藥品、農業等諸多領域。利用海藻多糖降解酶建立高效、綠色酶解工藝是未來海藻寡糖規模化生產的趨勢。酶工程、發酵工程等學科的日益完善和發展，有助于我們獲得酶活更高、穩定性更強的海藻多糖降解酶，并且實現這類工具酶的低成本生產，使其更適合應用于海藻多糖的綠色酶解工藝，開發功能性更強的海藻寡糖產品，進而提升我國海藻資源的高值化利用。