乳酸菌發酵接骨木果汁降血糖與抗氧化活性機理

封 弦， 翁佩芳*， 吳祖芳， 李 杲

（1.寧波大學 食品與藥學學院，浙江 寧波 315832；2.寧波市北侖玉健醫藥科技有限公司，浙江 寧波 315830）

接骨木（Sambucus nigra）為茜草目忍冬科接骨木屬植物，目前多集中于研究其根莖和花，而對接骨木果實的研究較少，僅局限于對接骨木果油的營養和生物活性的研究。接骨木果（Elderberry）富含蛋白質[1]、脂肪酸[2-3]、碳水化合物[4-5]、有機酸和維生素[6]等營養成分以及多酚[7]、黃酮[8-9]、花青素[10-11]和酚酸[12]等生物活性物質，是一種良好的藥食資源，可用于開發新的功能食品。

接骨木果中花青素含量較高，故具有顯著的抗氧化能力。Olejnik[13]等使用接骨木果提取物在人結腸膜細胞中進行抗氧化實驗，結果顯示降低了細胞中活性氧水平和DNA的損傷，說明接骨木果對結腸細胞氧化應激具有保護作用。Wu[11]等研究了15個水果樣品的抗氧化能力，結果顯示接骨木果和草莓的抗氧化活性最強。Milbury[14]等研究表明，接骨木果中的花青素的抗氧化能力比維生素C和維生素E強。有研究表明，接骨木果花青素能避免血管上皮細胞的氧化損傷，進而防止血管病變[15]。Bratu[16]等研究表明接骨木果的提取物能顯著清除氧自由基。其他研究也表明，接骨木果汁和果酒均具有抗氧化作用，并且接骨木果酒的抗氧化能力與生產過程中所用的糖和水的比例以及果實的細度有關[17-18]。乳酸菌發酵可以增加果蔬的營養和感官特性，延長貨架期，同時乳酸菌發酵也可以促進食品中植物化學成分的轉化[19]，從而產生大量新的代謝產物，因此相應的營養功能等也會發生變化[20]。

H2O2是一種常用的刺激細胞氧化損傷的工具，它作為氧化應激誘導劑誘導的HepG2細胞氧化損傷模型可控性強，具有一定的模擬性[21]，因此常應用于天然產物抗氧化研究中。

作者選用保加利亞乳桿菌BNCC336436和嗜熱鏈球菌ABT-T發酵接骨木果汁，通過DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率來判斷接骨木果汁發酵過程抗氧化活性變化；以未發酵為對照，進行發酵接骨木果汁酚類化合物細胞抗氧化實驗，比較發酵前后抗氧化活性變化并初步探究抗氧化機理，為接骨木果汁的發酵加工和果蔬發酵功能食品開發提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

接骨木果粉：寧波市北侖玉健醫藥科技有限公司提供；保加利亞乳桿菌BNCC336436（Lactobacillus bulgaricus，B）、嗜 熱 鏈 球 菌ABT-T（Streptococcus thermophilus，ST）：均保存于寧波大學食品與藥學學院食品生物技術實驗室；蔗糖：購于超市；MRS肉湯培養基、吐溫80、甘油：購于國藥集團化學試劑有限公司；HepG2細胞、PBS緩沖溶液、細胞凍存液和質量分數0.25%胰酶緩沖液（EDTA緩沖液）、乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒：購于北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養基、胎牛血清、鏈霉素、青霉素：購于美國Gibco公司；細胞培養瓶、6孔板、12孔板、96孔板：購于寧波航景生物有限公司；CCK-8試劑盒：購于美國Proteintech公司；細胞活性氧（ROS）檢測試劑盒、總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒：購于南京建成生物有限公司；qPCR實驗相關引物：購于生工生物工程（上海）股份有限公司；RNA提取試劑盒 （HiPure Bacterial RNA Kit，R4182）：購于廣州美基生物有限公司；反轉錄試劑盒（UEIrisⅡIRT-PCR Svstem for First-StrandcDNA Svnthesis，R2028）：購于蘇州宇恒生物科技有限公司；實時熒光定量檢測試劑盒（PerfectStarrTM Green qPCR SuperMix）：購于北京全式金生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

FA2004分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；ZJ-HCB-1200潔凈工作臺：廣州梓凈凈化設備有限公司；SPX智能生化培養箱：江南儀器廠；5418R低溫超速離心機：德國Eppendorf公司；311型細胞CO2培養箱、1300系列A2型生物安全柜、MK3酶標儀：美國賽默飛世爾科技有限公司；XSP-63XDV熒光倒置顯微鏡：上海光學儀器廠；HWS-11恒溫水浴鍋：上海慧泰儀器制造有限公司；LDZX-40B I型立式蒸汽滅菌器：上海申安醫療器械廠；DM-40L262-40℃冰箱：青島海爾特種電器有限公司；-80℃超低溫冰箱：賽默飛科技（蘇州）有限公司；qPCR儀：武漢俊杰電子有限公司；BD-252WY-20℃冰箱：容聲冰箱有限公司；SCIENTZ-18N冷凍干燥機：寧波新芝儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化取新鮮保藏的B和ST試管斜面分別接種至MRS肉湯培養基中，于37℃恒溫靜置培養18 h得到菌種活化液，備用。

1.3.2 發酵接骨木果汁的制備按料液質量體積比1 g∶50 mL配制接骨木果汁，加入質量分數4%的蔗糖，經85℃水浴滅菌15 min后降至室溫得到發酵基質。將B和ST按體積分數3%接入發酵基質中，于37℃恒溫靜置發酵36 h。

1.3.3 發酵接骨木果汁酚類化合物的提取與純化分別取一定量的未發酵和發酵接骨木果汁與無水乙醇按體積比1∶1混合均勻，然后超聲提取30 min（功率40 W，溫度40℃）后過濾，得到的濾渣再按體積比1∶1的比例加入無水乙醇進行提取，重復提取3次，將收集到的提取液旋轉蒸發至無醇味，即得到酚類化合物的粗提取物，于4℃保存待純化。 采用AB-8大孔吸附樹脂對接骨木果汁酚類化合物的粗提取物進行純化。具體操作步驟為：1）AB-8大孔吸附樹脂經無水乙醇浸泡24 h使其活化，用蒸餾水沖洗至無醇味；2）取適量烘干活化好的AB-8樹脂倒入燒杯中備用；3）在燒杯中加入酚類物質粗提取物濃縮液、無水乙醇和AB-8大孔樹脂，攪拌均勻放置磁力攪拌器攪拌過夜；4）收集乙醇洗脫液，將洗脫液旋轉蒸發至無醇味，備用；5）經冷凍干燥后得到接骨木果汁的酚類化合物純化物。

1.3.4 DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除能力的測定DPPH自由基清除能力的測定參照馮文娟[22]等的方法；超氧陰離子清除能力的測定參照文獻[23]的方法；羥自由基清除能力的測定參考鄭時蓮[24]等的方法。

1.3.5 α-淀粉酶抑制實驗α-淀粉酶抑制率用3，5-二硝基水楊酸試劑法測定[25]。稱取α-淀粉酶粉末用pH 6.8的PBS溶液配制成質量濃度為0.04 mg/mL的α-淀粉酶溶液。取1 mL樣品與1 mL α-淀粉酶溶液，搖勻，25℃靜置反應10 min。隨后加入1 mL體積分數1%可溶性淀粉（pH 6.8的PBS溶液溶解），再加入1 mL DNS溶液沸水浴5 min進行顯色反應，冷卻至室溫。加入蒸餾水稀釋至10 mL，540 nm處檢測吸光值，空白組以蒸餾水做對照。

式中：Ac為空白組吸光值，As為樣品組吸光值。

1.3.6 α-葡萄糖苷酶抑制實驗α-葡萄糖苷酶抑制率參考Marilisa[26]的方法，稍做修改。具體操作為：分別取1 mL磷酸鹽緩沖液、0.2 mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.4 mL果汁發酵液加入試管中搖勻，37℃水浴10 min，加入0.5 mL pNPG溶液搖勻，再于37℃水浴10 min，最后加入8 mL Na2CO3溶液，于405 nm處測定其吸光值，結果記為A1。取2支試管做對照實驗，其中不加底物pNPG的試管吸光值記為A2，另一支不加果汁的試管吸光值記為A3。

式中：A1為添加α-葡萄糖苷酶溶液、果汁和底物pNPG的吸光值，A2為添加α-葡萄糖苷酶溶液和果汁的吸光值，A3為添加α-葡萄糖苷酶溶液和底物pNPG的吸光值。

1.3.7 細胞復蘇、培養和傳代將HepG2細胞在培養瓶中培養至狀態良好后灌滿培養基并轉移到生物安全柜中操作。如細胞生長至70%~80%，將瓶中的培養基移入無菌瓶中留作培養使用，保留5~8 mL培養基在培養箱（37℃、5% CO2）中繼續培養。細胞培養至90%~100%后，按要求消化傳代。棄去培養基，細胞用無菌PBS緩沖液清洗2次，加入適量胰蛋白酶消化，待細胞完全脫壁后加入培養基吹打均勻，分瓶培養，按需傳代或鋪板。

1.3.8 細胞凍存將培養至90%~100%的HepG2細胞于生物安全柜中棄掉舊培養基，用PBS緩沖液清洗2遍，然后加入適量0.25% EDTA溶液消化2~3 min后，加入新鮮培養基終止消化。最后將細胞收集至15 mL離心管中，于1 000 r/min離心5 min，棄掉培養基，將細胞凍存液（提前預冷）加入細胞中，吹打之后分裝到2 mL細胞凍存管中，寫好標簽后，用封口膜封好，最后放至-80℃超低溫冰箱中保存。

1.3.9 建立HepG2細胞氧化損傷模型以未經過樣品和H2O2處理的細胞作為空白對照組，經過不同濃度的H2O2處理的細胞為模型組，經過樣品處理再經過H2O2處理的細胞作為實驗組。選擇質量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2溶液（DMEM培養基配制）作為本實驗濃度，將生長至對數期的HepG2細胞接種于96孔板中，每個孔中加入200 μL細胞懸液后置于培養箱（37℃、5% CO2）中培養24 h，棄去舊培養基，用PBS緩沖液清洗1次，每個孔中加入不同質量濃度的200 μL H2O2溶液繼續培養4 h后測定細胞存活率，獲得HepG2細胞氧化損傷模型。

1.3.10 HepG2細胞毒性實驗按照CCK-8試劑盒步驟進行測定。

1.3.11 ROS、LDH、T-AOC和CAT活力的測定取適量經過處理的細胞培養液，嚴格按照相應的測定試劑盒測定步驟進行。其中ROS以熒光強度計，LDH用相對釋放率表示，T-AOC單位為U/mL，CAT其活力單位為U/mL。

1.3.12 RNA提取及反轉錄HepG2細胞培養結束后，分別收集各組細胞。總RNA的提取根據RNA提取試劑盒提供的方法執行，接著使用反轉錄試劑盒對提取的RNA進行反轉錄，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。GAPDH購自生工生物工程（上海）股份有限公司，貨號B661104。

表1 qPCR引物序列Table 1 Sequence of qPCR primer

1.3.13 數據分析每組實驗進行3次重復，結果以均值±標準偏差表示。利用SPSS軟件對數據進行分析，使用Origin軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌發酵接骨木果汁體外抗氧化活性變化

乳酸菌發酵接骨木果汁過程中抗氧化能力的變化見圖1。可以看出，發酵接骨木果汁對DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除能力呈現一致的趨勢，隨著發酵時間的增加對自由基的清除率提高，且發酵結束時接骨木果汁的抗氧化能力最大。經菌種B和ST發酵后，接骨木果汁對DPPH自由基的清除能力從44.67%提高到了60.76%，對羥自由基清除率達到了75.37%，較未發酵果汁提高了20.39%，對超氧陰離子的清除能力從43.27%增加到了57.45%，表明接骨木果汁經過乳酸菌發酵后提高了抗氧化能力。這可能是由于乳酸菌發酵過程中發酵基質中酚類和黃酮類化合物的釋放以及乳酸菌分泌的抗氧化酶的抗氧化能力不同引起的。延莎[27]等使用乳酸菌發酵茶花粉后發現其總多酚和總黃酮含量都有明顯的增加，發酵茶花粉提取物對DPPH自由基、ABTS自由基等自由基的清除能力均高于對照組。沙棘-蘋果汁的復合果汁經不同種類乳酸菌發酵后，植物乳桿菌對其黃酮醇含量和抗氧化能力的提高更為明顯[28]。乳清蛋白藍莓汁混合物經保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌單獨發酵和混菌發酵后對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基清除率和脂質過氧化能力與發酵前相比均有提高[29]。

圖1 接骨木果汁發酵過程中DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子清除率的變化Fig.1 Changes in the scavenging rates of DPPH radicals，hydroxyl radicals and superoxide anions during the fermentation of elderberry juice

2.2 酶抑制實驗

α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶可以分解碳水化合物，從而增加人體血糖水平，通過抑制這兩種酶的活性可以有效地延緩糖類的水解從而起到降低血糖的作用。保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵接骨木果汁過程中對這2種酶抑制能力變化見圖2。從圖2可以看出，發酵接骨木果汁對α-葡萄糖苷酶的抑制率隨發酵時間的延長而增加；經36 h的發酵，接骨木果汁對α-葡萄糖苷酶的抑制率從52.97%提高至72.39%，對α-淀粉酶的抑制率從48.75%增加到68.62%，表明乳酸菌發酵有效提高了接骨木果汁的酶抑制能力。有文獻報道，Aronia果汁經發酵后具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性[30]。李云姣[31]等發現，水果酵素在發酵120 d后對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制率分別達到了99.57%和81.67%，證明水果酵素具有良好的降血糖作用。有研究表明，采用植物乳桿菌發酵黑葡萄汁后對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性顯著提高[32]。南瓜乳酸菌發酵飲料對α-葡萄糖苷酶的抑制率達到（95.89±0.03）%[33]，證明南瓜經乳酸菌發酵可用于開發降糖飲料。

圖2 接骨木果汁發酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制能力的變化Fig.2 Changes in the inhibitory capacity of α-glucosidase and α-amylase during the fermentation of elderberry juice

2.3 乳酸菌發酵接骨木果汁酚類化合物對HepG2細胞的毒性作用

不同質量濃度酚類物質作用下HepG2細胞存活率見圖3。可以看出，發酵前后的接骨木果汁酚類化合物質量濃度在0~500 μg/mL范圍內作用于HepG2細胞，細胞存活率均在85%以上，說明在該質量濃度范圍內，酚類化合物對HepG2細胞無明顯毒性作用。

圖3 不同質量濃度接骨木果汁酚類物質作用下的HepG2細胞存活率Fig.3 Survival of HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances of elderberry juice

2.4 H2O2誘導HepG2細胞氧化損傷質量濃度的確定

為了確定H2O2的刺激濃度，選取質量濃度0、125、250、500、1 000 μg/mL的H2O2對HepG2細胞進行氧化刺激，不同質量濃度作用下HepG2細胞存活率見圖4。從圖4可以看出，H2O2質量濃度在0、125、250 μg/mL下HepG2細胞存活率都在80%以上，說明該質量濃度范圍內H2O2對HepG2細胞沒有造成氧化損傷；而在500、1 000 μg/mL質量濃度刺激下，HepG2細胞存活率分別為47.31%和31.27%，如果細胞存活率太高或太低，那么樣品對HepG2細胞的作用效果就會不明顯，參考意義不大[34]。因此選擇刺激條件下細胞存活率接近50%的H2O2質量濃度進行下一步分析。

圖4 不同質量濃度H2O2刺激下HepG2細胞存活率Fig.4 Survival rate of HepG2 cells under different mass concentrations of H2O2 stimulation

2.5 接骨木果汁酚類物質對HepG2細胞氧化損傷的保護作用

通過實驗篩選了誘導HepG2細胞氧化損傷的H2O2質量濃度。從圖5可以看出，在質量濃度為100、200、300、400、500 μg/mL未發酵和發酵接骨木果汁酚類物質質量濃度作用下，HepG2細胞的存活率都高于刺激組，說明酚類物質可有效降低H2O2對HepG2細胞的氧化損傷程度。而在200 μg/mL和300 μg/mL時，細胞存活率接近85%，有利于下一步實驗的開展。為了確保下一步實驗順利進行，作者研究了200 μg/mL和300 μg/mL接骨木果汁酚類物質對HepG2細胞氧化損傷的保護作用。

圖5 不同質量濃度酚類物質作用下HepG2細胞的存活率Fig.5 Survival rate of HepG2 cells under the effect of different mass concentrations of phenolic substances

2.6 ROS、T-AOC、CAT、LDH的測定

不同處理條件下HepG2細胞中ROS水平的變化見圖6。可以看出，與空白組相比，僅添加H2O2處理后提高了HepG2細胞中ROS的水平，說明促進了氧化應激的發生；而HepG2細胞經質量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質預處理后明顯減弱了氧化應激作用，抑制了ROS的積累，說明酚類物質在一定程度上起到了保護作用。為了探究接骨木果汁酚類物質對H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激的保護作用，HepG2細胞先用酚類物質預處理24 h，然后測定HepG2細胞T-AOC、CAT和LDH相對釋放率的變化，結果見圖6。經質量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞總抗氧化能力顯著提高，并且呈現一定的劑量依賴性，說明酚類物質的作用降低了HepG2細胞的氧化損傷程度。發酵接骨木果汁酚類物質的總抗氧化能力比未發酵酚類物質強。同時，用質量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞的過氧化氫酶活力顯著高于對照組，說明酚類物質可以有效降低H2O2誘導的HepG2細胞氧化應激。乳酸脫氫酶的釋放可能是因為在H2O2的刺激下細胞膜受到損傷，通透性增加，從而導致細胞中乳酸脫氫酶濃度的增加。如圖6所示，用質量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞的乳酸脫氫酶相對釋放率明顯高于空白組，但遠遠低于對照組。這些都說明酚類物質在一定程度上降低了H2O2對HepG2細胞膜的破壞。

圖6 不同質量濃度酚類物質作用下HepG2細胞ROS、T-AOC、CAT和LDH的變化Fig.6 Changes of ROS，T-AOC，CAT and LDH in HepG2 cells under the different mass concentrations of phenolic substances

2.7 抗氧化酶相關基因表達的變化

抗氧化酶可以保護細胞免受氧化應激的損害，抑制細胞中ROS的過量生成，以維持細胞氧化還原平衡。同時，抗氧化酶可以將過氧化物轉化為毒性較小或無害的物質。通過測定HO-1、NQO1和GCLC基因相對表達量，證明酚類物質處理后是否提高了相關酶的抗氧化活性。HO-1可以催化血紅素分解，生成的小分子產物具有抗氧化損傷的功能[35]，是一種重要的抗氧化酶。如圖7所示，HO-1的基因表達在經H2O2處理的HepG2細胞中明顯降低，而在經200、300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞中明顯提高。NQO1可以通過還原反應降低ROS的產生，因此NQO1能阻止外源性刺激條件對DNA造成氧化損傷，是重要的抗氧化酶之一。在H2O2刺激下HepG2細胞中的NQO1基因表達量減少，而采用質量濃度為200、300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞中NQO1基因表達量明顯增加。同時，經H2O2刺激后HepG2細胞中GCLC表達量減少，使用質量濃度200 μg/mL和300 μg/mL酚類物質預處理的HepG2細胞中NQO1基因表達量上升。因此可以說明酚類物質可以加強HepG2細胞中抗氧化酶相關基因的表達量。

圖7 不同質量濃度酚類物質作用下HepG2細胞氧化損傷模型中的抗氧化酶相關基因相對表達Fig.7 Relative expression of antioxidant enzyme-related genes in a model of oxidative damage in HepG2 cells under the different phenolic substance mass concentrations

3 結語

選用B和ST發酵接骨木果汁后，果汁的抗氧化活性提高，對α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制能力也提高。研究還表明，用酚類物質預處理HepG2細胞后，細胞T-AOC、CAT明顯提高；LDH相對釋放率明顯增加并且降低了細胞中活性氧的積累；這說明酚類物質能使HepG2細胞免受H2O2氧化損傷，并且發酵后的酚類物質作用比發酵前強。細胞抗氧化實驗證明，HO-1、NQO1和GCLC相關抗氧化酶的基因表達在經H2O2處理的HepG2細胞中明顯降低，而經酚類物質預處理的HepG2細胞中明顯提高。由此可見，發酵后果汁抗氧化能力提高的原因可能是在酚類物質的作用下提高了HepG2細胞中相關抗氧化酶的基因表達水平。